撒坝猪MCUR1基因克隆、生物信息学分析及其组织表达量检测

本研究克隆了撒坝猪MCUR 1基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测其在撒坝猪、大白猪不同组织中的表达水平。根据GenBank上公布的猪的MCUR1基因序列(登录号:XM_003128183.4)设计引物,通过PCR扩增及测序获得撒坝猪MCUR 1基因CDS序列,该序列全长1095 bp,编码364个氨基酸;MCUR1蛋白的分子式C1787H2949N533O503S14,相对分子质量40.398 ku,理论等电点(pI)10.27,不稳定系数55.70,脂肪指数95.99,平均亲水性为-0.213,属于亲水蛋白;MCUR1蛋白没有信号肽和跨膜结构,含有2个螺旋卷曲结构,主要在细胞质中发挥生物学功能;含有32个磷酸化位点;含有一个CpG island;二级结构由58.24%的α-螺旋,4.12%的β-转角,30.22%的无规则卷曲,7.42%的延伸链构成;猪MCUR 1基因编码区序列与牛、鸡、狗、山羊、人、猴、鼠、绵羊的同源性分别为85.3%、68.0%、83.6%、87.9%、84.4%、80.3%、76.8%、88.2%,与绵羊、山羊、牛的亲缘关系较近,与鸡的关系较远;在肝脏中的表达量最多,肺脏中的表达量最少。在大白猪的背最长肌中MCUR 1的表达量高于撒坝猪的背最长肌(P<0.01)。

MCUR1蛋白的表达纯化以及晶体初筛

Mitochondrial Ca^(2+)Uniporter(MCU)是线粒体钙离子通道的一个主要成分.近期研究发现Mitochondrial calcium uniporter regulator 1(MCUR1)是MCU的一个调节蛋白.研究通过合成人源的MCUR1基因,利用PCR得到目的DNA片段,克隆到表达载体PET.32a,构建Trx-MCUR1融合蛋白表达质粒PET.32aMCUR1.克隆质粒转化表达菌E.coli BL21(DE3)Condon Plus,经IPTG诱导表达.将得到的融合蛋白经过镍亲和层析柱进行初步纯化,然后加入PreScission酶分离目的蛋白与标签,再用离子柱和分子筛层析进行进一步的纯化以去除标签以及杂蛋白.浓缩纯化后的目的蛋白,进行晶体初筛以及后期的晶体优化.最后将生长的晶体进行初步的X射线衍射分析.

HBV HBx蛋白调控肝癌细胞增殖的机制研究

目的探讨HBV HBx蛋白调控肝癌细胞增殖的潜在机制.方法过表达HBx后,检测肝癌细胞HepG2的增殖水平.在过表达Flag-HBx的肝癌细胞HepG2中免疫共沉淀HBx后进行蛋白质质谱鉴定,Score阈值设定为大于50,Coverage阈值设定为大于10.过表达HBx的肝癌细胞HepG2中,使用siRNA敲低质谱鉴定的相应基因,检测HepG2的增殖水平.结果过表达Flag-HBx后,肝癌细胞HepG2的增殖水平上升(P<0.05).与对照组比较,敲低MCUR1后肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(P<0.05).与对照组比较,同时过表达MCUR1和HBx能够促进肝癌细胞HepG2的增殖(P<0.05),而仅过表达MCUR1对肝癌细胞HepG2的增殖无显著影响.与过表达HBx组比较,过表达HBx的同时敲低MCUR1时肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(P<0.05).与对照组比较,过表达HBx后肝癌细胞HepG2的ROS水平上升(P<0.05);与对照组比较,过表达HBx的同时敲低MCUR1时肝癌细胞HepG2的ROS水平无显著变化.与对照组或过表达HBx组比较,同时过表达MCUR1和HBx能够增加肝癌细胞HepG2的ROS水平(P<0.05).与过表达HBx组比较,过表达HBx的同时敲低MCUR1时肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(P<0.05),但这种下降能被H2 O2恢复.与对照组比较,过表达HBx后肝癌细胞HepG2中转录因子Nrf2在细胞核中的定位增加(P<0.05),而过表达HBx的同时敲低MCRU1后Nrf2在细胞核中的定位无显著变化.与对照组比较,过表达HBx后肝癌细胞HepG2中转录因子Notch的激活形式NICD1在细胞核中的定位增加(P<0.05),而过表达HBx的同时Nrf2抑制剂ML385处理后NICD1在细胞核中的定位无显著变化.与过表达HBx组比较,过表达HBx的同时ML385处理后肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(P<0.05).与过表达HBx组比较,过表达HBx的同时Notch抑制剂IMR-1处理后肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(P<0.05).结论HBx促进HepG2细胞增殖与MCUR1/ROS/Nrf2/Notch轴有关.