ADM与5Fu可抑制MDA-MB231乳癌细胞的SNCG表达

目的研究乳癌临床常用化疗药物顺铂(cisplatin or DDP),阿霉素(adriamycin,ADM),氟尿嘧啶(fluorouracil,5Fu)对MDA-MB231乳癌细胞SNCG表达的干扰效应。方法通过RT-PCR及免疫组织化学法检测上述药物处理组和阴性对照组MDA-MB231细胞的SNCG表达状况,用Quantity One软件及北航真彩色医学图像处理系统(CM-2000B)分别对各组SNCG mRNA和蛋白相对表达水平进行分析。结果ADM和5Fu处理组与阴性对照组比较,MDA-MB231细胞的SNCG mRNA及蛋白表达水平差异均有统计学意义(P值均小于0.05),而DDP处理组表达水平与对照组无差别。结论ADM和5Fu可抑制MDA-MB231细胞的SNCG表达。

白藜芦醇诱导人乳腺癌MDA-MB231细胞凋亡及自噬

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)诱导人乳腺癌MDA-MB231细胞凋亡及自噬蛋白表达的作用与机制。方法以人乳腺癌MDA-MB231细胞为研究对象,MTT法检测Res(0、1、5、10、20、50、100、200 mg·L^(-1))抑制MDA-MB231细胞增殖情况; Res(0、5、20、60 mg·L^(-1))处理MDA-MB231细胞,划痕实验检测细胞迁移能力,Annexin V/PI双染法检测细胞早期凋亡率,免疫荧光法检测细胞LC3Ⅰ/Ⅱ的表达;Res(0、20、60 mg·L^(-1))处理MDA-MB231细胞,蛋白免疫印迹法检测细胞中自噬相关蛋白p62及Beclin-1的表达。结果Res在体外可明显抑制MDA-MB231细胞增殖,且呈浓度依赖关系。随着Res浓度的增高,乳腺癌细胞迁移能力较对照组分别下降了(8. 7±1. 1)%、(16. 5±2. 9)%和(32. 2±3. 6)%。流式细胞仪检测结果表明,早期凋亡细胞数增加;激光共聚焦检查显示,细胞质中LC3Ⅰ/Ⅱ绿色荧光增加;蛋白免疫印迹法检测出MDA-MB231细胞p62蛋白表达下降,Beclin-1蛋白表达升高。结论 Res可抑制人乳腺癌MDA-MB231细胞增殖,其机制可能与Res诱导细胞凋亡和自噬有关。

二吲哚吡啶基吡咯烷通过抑制AKT-mTOR阻滞MDA-MB231乳腺癌细胞周期

探索吡咯烷衍生物的螺旋吲哚化合物二吲哚吡啶基吡咯烷(Di-indolyl pyrrolidine,DIPRD)对人乳腺癌MDAMB231细胞周期的阻滞作用。使用CCK-8法检测DIPRD对MDA-MB231细胞的毒性剂量;使用DAPI/Ed U双染法检测MDA-MB231细胞周期阻滞作用;使用Western blot检测信号通路蛋白AKT、mTOR和凋亡相关蛋白p53、MDM2的磷酸化水平以及DNA修复酶PARP的水平。DIPRD在12. 5、25、50 mg/m L剂量依赖性抑制MDA-MB231细胞活力,下调EdU阳性细胞数量,增加G_1期并减少S/G_2期细胞数量,下调p-AKT(Ser473)、p-mTOR、p-p53、cyclin D1和CDK4水平并上调p-AKT(Thr308),p-MDM2及Cleaved-PARP水平。DIPRD可能通过AKT信号通路发挥周期阻滞作用。

重组pEGFP-N1-CD_(146)表达载体的构建及其对MDA-MB-231细胞侵袭的影响

目的构建CD146基因的过表达载体,研究其对乳腺癌细胞MDA-MB231侵袭的影响。方法构建CD146基因的过表达载体,转染细胞MDA-MB231,RT-PCR、Western blot分别检测CD146mRNA、蛋白水平的表达。Transwell实验观察细胞侵袭能力。结果酶切、测序结果表明pEGFP-N1-CD146载体构建成功;RT-PCR、Western blot显示实验组转染后CD146mRNA和蛋白水平表达较对照组均增高(P<0.05)。Transwell实验表明,与对照组相比,pEGFP-N1-CD146实验组细胞侵袭能力明显增强(P<0.05)。结论 CD146过表达载体构建成功,该因子可促进乳腺癌细胞侵袭能力。

IGF-1R对乳腺癌细胞株MDA-MB231细胞增殖及迁移能力的影响

目的:研究IGF-1R基因对乳腺癌细胞株MDA-MB231细胞增殖及迁移能力的影响。方法:将本课题组前期构建的质粒p EGFP-N1-IGF-1R转染入MDA-MB231细胞系,采用Western blot法和Realtime PCR法检测IGF-1R蛋白与mRNA的表达情况;通过MTT法和Transwell法检测p EGFP-N1-IGF-1R对MDA-MB231细胞增殖及迁移侵袭能力的影响。结果:p EGFP-N1-IGF-1R转染入MDA-MB231细胞后,其IGF-1R的表达水平明显上调;与空白对照组和空载体组相比,过表达组细胞增殖能力明显增强(P <0. 05),细胞迁移能力增强(P <0. 05)。结论:IGF-1R基因能够增强MDA-MB231细胞的增殖能力及迁移能力。

SiRNA沉默Pim-1基因转染MDA-MB231细胞情况对放疗敏感性的影响

目的使用SiRNA沉默Pim-1基因转染MDA-MB231细胞,分析转染情况对细胞活性及放疗敏感性的影响。方法使用SiRNA转染液对MDA-MB231细胞进行转染,采用Western blot法筛选,根据转染结果分为空白组(没有转染)、阴性组(转染后未测出MDA-MB231/siRNA序列)、阳性1组(转染后测出MDA-MB231/siRNA1序列)、阳性2组(转染后测出MDA-MB231/siRNA2序列)、阳性3组(转染后测出MDA-MB231/siRNA3序列),每组60孔。每组细胞又细分为3个小组,每个小组20孔板,分别接受3个梯度(2 mV、4 mV、8 mV)X线的单次照射。比较5组MDA-MB231细胞增殖率、凋亡率、放疗敏感性蛋白含量(p38、p-p38、Cleaved Caspase-3)的差异。结果5组MDA-MB231细胞增殖率和凋亡率差异均明显(P<0.05),两两比较,阳性1组、阳性2组、阳性3组与空白组(或阴性组)间差异有统计学意义(P<0.05);X线进行细胞照射的剂量越高,细胞增殖率越低(P<0.05)、凋亡率越高(P<0.05);3个阳性组分别与空白组(或阴性组)比较,p-p38、Cleaved Caspase-3蛋白表达含量的差异有统计学意义(P<0.05),阳性组细胞表达含量相对较高。结论SiRNA沉默Pim-1基因转染MDA-MB231细胞可降低细胞增殖率、提高细胞凋亡率,测出siRNA3序列的MDA-MB231细胞尤为明显;细胞放疗敏感性的差异可能与耐药蛋白的产生有关。

miR-340对乳腺癌MDA-MB231细胞增殖和凋亡的影响

背景与目的:既往研究表明,微小RNA-340(miR-340)能负性调控多种肿瘤的进展,但其在乳腺癌细胞增殖和凋亡中的研究较少,本研究旨在探讨miR-340对乳腺癌MDA-MB231细胞增殖和凋亡的作用。方法:利用脂质体LipofectamineTM2000将pre-miR-340或anti-miR-340瞬时转染至乳腺癌MDA-MB231细胞,通过RT-PCR检测miR-340 mRNA的水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测cleaved-caspase-3蛋白的表达,MTT比色法检测细胞增殖的抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:Pre-miR-340增加了MDA-MB231细胞中miR-340表达,同时增加cleaved-caspase-3蛋白表达、抑制MDA-MB231细胞增殖并促进其凋亡。而anti-miR-340抑制了MDAMB231细胞中miR-340表达,并且抑制cleaved-caspase-3蛋白表达,促进了MDA-MB231细胞增殖,抑制了MDAMB231细胞的凋亡。结论:miR-340转染后能上调MDA-MB231细胞中cleaved-caspase-3蛋白的表达从而抑制细胞增殖,促进其凋亡。

ST3GAL4对MDA-MB-231增殖及c-met通路的影响探究

目的 探讨唾液酸转移酶ST3GAL4对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖和c-met通路的影响。方法 分别设计3段针对ST3GAL4编码区的siRNA,通过RT-PCR和Western blot两种方法分别对其mRNA水平和蛋白水平进行检测;接着通过敲减ST3GAL4观察MDA-MB-231平板克隆形成能力和c-met磷酸化水平。结果 向胞内转染siRNA 之后40小时,ST3GAL4的mRNA 水平和蛋白质水平较对照组(siNC)均有降低;相较于对照组,敲减组(si ST3GAL4) MDA-MB-231克隆形成能力明显减弱(p<0.05),c-met通路活化受到抑制。 结论 ST3GAL4可能参与MDA-MB-231的增殖与关键信号通路c-met的激活。

抗原负载的DC诱导CIK对MDA-MB-231细胞的杀伤活性研究

探讨乳腺癌相关抗原负载后树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对MDA-MB-231乳腺癌细胞株的杀伤效应。采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(PBMC),常规法诱导DC、CIK细胞;流式细胞技术分析测定细胞表型;用反复冻融法制备MDA-MB-231细胞的相关抗原,并测定抗原浓度;MTT法分别测定在四个不同效靶比时CIK、DC+CIK和抗原负载的DC+CIK三组效应细胞对MDA-MB-231乳腺癌细胞的杀伤活性。结果:CIK细胞分别与DC和Ag-DC共培养后,可见CD3+CD56+双阳性表达细胞较培养前显著增加(P<0.05);将负载肿瘤相关抗原的DC与CIK共培养后,杀瘤活性明显提高(P<0.05)。提示,抗原负载的DC与CIK细胞共同孵育培养后,在相同效靶比时,对MDA-MB-231乳腺癌细胞杀伤效应与CIK细胞和DC-CIK两组效应细胞相比有显著提高,表明抗原负载后可提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,为乳腺癌临床生物免疫治疗提供实验室基础。

红花蜂花粉多糖组分(PBPC-Ⅱ)对人乳腺癌MDA-MB231细胞生长的影响及作用机制

目的探究红花蜂花粉多糖组分Ⅱ(PBPC-Ⅱ)对人乳腺癌MDA-MB231细胞凋亡和生长的影响及作用机制。方法体外培养MDA-MB231细胞,对照孔不给药物,实验孔依次添加终浓度为0.12,0.24,0.48,0.96 mg/mL的PBPC-Ⅱ,处理时间分别为12,24,36 h, MTS法检测PBPC-Ⅱ对MDA-MB231细胞的增殖影响,且筛选出最适药物浓度;流式细胞实验检测细胞凋亡情况;qPCR及Western blot实验检测Bcl-2、Bax、P53、C-myc基因及蛋白表达水平变化。结果 PBPC-Ⅱ可促进MDA-MB231细胞的凋亡。qPCR及Western blot实验结果显示,PBPC-Ⅱ可在分子水平上,抑制C-myc、Bcl-2基因转录与蛋白表达,增强P53、Bax基因及蛋白的表达。结论 PBPC-Ⅱ可抑制MDA-MB231细胞的生长并加速凋亡,其作用机制可能与抑制细胞增殖,P53、Bax基因表达上调,下调C-myc、Bcl-2基因表达有关。

金雀异黄素和槲皮素对人类乳腺癌细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨金雀异黄素(genistein,Gen)和槲皮素(quercetin,Que)对人类乳腺癌细胞株增殖的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法测定槲皮素对雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7、T47D和非雌激素依赖性乳腺癌细胞MDA-MB231的细胞增殖作用,并以雌激素受体拮抗剂ICI182780为工具药来评价金雀异黄素、槲皮素发挥雌激素样作用与雌激素受体的关系,流式细胞术对MCF-7细胞的增殖情况进行分析。结果Gen和Que在一定剂量范围内能促进T47D和MCF-7细胞的增殖,而对雌激素受体阴性MDA-MB231细胞未见增殖作用,并将MCF-7细胞周期由G1期向S期推进,促进DNA合成,提高细胞分裂增殖指数,且Gen和Que促进MCF-7细胞增殖作用被雌激素受体拮抗剂所拮抗。结论金雀异黄素和槲皮素具有雌激素活性,此作用可能是通过雌激素受体(ER)介导的。

补骨脂素对人类乳腺癌细胞增殖作用的影响

目的研究补骨脂素(psoralen,Pso)对人类乳腺癌细胞株增殖的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法测定补骨脂素对雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7和非雌激素依赖性乳腺癌细胞MDA-MB231的细胞增殖作用,并以雌激素受体拮抗剂ICI182,780为工具药来评价补骨脂素发挥雌激素样作用与雌激素受体的关系,流式细胞术对MCF-7细胞的增殖情况进行分析。结果与溶剂对照组相比较,Pso(10～40μmol.L-1)能明显促进MCF-7细胞的增殖,而对雌激素受体阴性MDA-MB231细胞未见影响,并将MCF-7细胞周期由G1期向S期推进,促进DNA合成,提高细胞分裂增殖指数,且Pso促进MCF-7细胞增殖作用被雌激素受体拮抗剂所拮抗。结论补骨脂素具有雌激素活性,此作用是通过雌激素受体(ER)介导的。

转录因子Snail调控上皮-间质转型及对肿瘤转移的逆转作用

背景与目的:研究表明转录因子Snail调控上皮-间质转型(epithelialtomesenchymaltransition,EMT)与肿瘤转移有一定的相关性。本研究通过观察Snail促进EMT以及反义Snail对肿瘤细胞EMT的逆转,明确Snail在肿瘤转移中的作用。方法:分别以SnailcDNA转染MDCK细胞,反义Snail转染MDA-MB231细胞。Westernblot法检测上皮性标记基因上皮钙粘附素(E-cadherin)、β-连环素(β-catenin)、角蛋白18(Cytokeratin18)与间质性标记基因纤粘蛋白(Fibronectin)及转移相关基因基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、RhoA蛋白的改变;细胞划痕实验、Boyden小室体外侵袭实验反映细胞转移潜能的变化。结果:转染SnailcDNA的MDCK细胞,上皮标记基因E-cadherin、β-catenin、Cytokeratin18蛋白表达下调,而间质及转移相关基因Fibronectin、MMP-2、RhoA蛋白表达增强(P<0.05);细胞体外运动力与侵袭力增加(P<0.05);反义Snail转染MDA-MB231细胞后,其实验结果与经SnailcDNA处理后的MDCK细胞相反。结论:Snail能促进正常上皮细胞发生EMT,拮抗肿瘤细胞Snail的表达可逆转EMT表型、降低肿瘤转移潜能。

成骨细胞诱导乳腺癌侧群细胞获得骨模拟特性的研究

目的以乳腺癌细胞株MDA-MB231和成骨细胞株MC3T3-E1为对象,研究在共培养条件下乳腺癌侧群细胞向成骨细胞转化的能力。方法通过流式细胞技术分选出MDA-MB231乳腺癌侧群细胞,将其与成骨细胞株MC3T3-E1按照1∶1的细胞比例分别置于Transwell间接共培养体系的上、下小室中(实验组),设置相同密度的单纯乳腺癌侧群细胞为对照组,观察侧群细胞的形态变化。通过细胞免疫荧光技术及Western blot,比较2组侧群细胞中OPN、Runx2、Wnt-1表达水平的改变。结果实验组细胞分化明显,细胞免疫荧光技术检测实验组侧群细胞中OPN、Runx2、Wnt-1表达水平明显高于对照组。Western blot检测表明实验组侧群细胞中OPN(5.15±0.35)、Runx2(6.22±0.36)、Wnt-1(9.30±0.28)的蛋白表达水平均高于对照组OPN(1.00±0.15)、Runx2(1.00±0.14)、Wnt-1(1.00±0.13),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论与成骨细胞株共培养后,乳腺癌侧群细胞获得成骨细胞相关生物学特性。

异补骨脂素的植物雌激素作用及其机制的探讨

目的利用雌激素受体(estrogenic receptor,ER)阳性乳腺癌T47D细胞和ER阴性乳腺癌MDA-MB231细胞观察异补骨脂素(isopsoralen)的雌激素样作用,并探讨其可能的作用靶点和机制。方法以ER拮抗剂ICI182,780为工具药,采用MTT细胞增殖实验观察异补骨脂素对T47D和MDA-MB231细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测细胞周期分布的变化。同时,利用实时荧光定量PCR法及流式细胞术检测异补骨脂素对T47D细胞pS2 mRNA及蛋白表达情况的影响。结果1×10-6mol·L-1和1×10-7mol·L-1异补骨脂素能够促进T47D细胞增殖,提高细胞分裂增殖指数,且该作用可被ICI182,780所拮抗;1×10-6mol·L-1和1×10-7mol·L-1异补骨脂素对MDA-MB231细胞增殖无影响。PCR及流式蛋白检测结果显示:1×10-6mol·L-1和1×10-7mol·L-1异补骨脂素可使pS2 mRNA和蛋白表达增加,同时加入ICI182,780可部分拮抗异补骨脂素对pS2表达的诱导和促进作用。结论异补骨脂素具有植物雌激素作用,该效应可通过作用于靶细胞雌激素受体途径实现。

ERK抑制剂U0126通过下调cyclin D1与survivin蛋白表达抑制乳腺癌细胞增殖

目的 研究ERK通路抑制剂U0126对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,并探讨其调控机制。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB231,将细胞分组干预,MTT法检测各组细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡;Western blot检测细胞中p-ERK/ERK、cyclin D1、survivin及cleaved caspase-3蛋白表达。结果 MTT结果显示,U0126干预24、48 h后,MCF-7、MDA-MB231细胞抑制率明显增加(P<0.01);MCF-7、MDA-MB231细胞经U0126干预24 h后,检测细胞周期及细胞凋亡,G 0/G 1期细胞比例较对照组明显增加,S及G 2期细胞比例下降(P<0.05);而干预组细胞凋亡率较未干预组明显增多(P<0.01);U0126处理人乳腺癌细胞2 h后,可阻断ERK的磷酸化,减少cyclin D1的蛋白表达,抑制survivin而上调cleaved caspase-3的表达,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。结论 U0126通过阻断MCF-7、MDA-MB231细胞中ERK信号通路,调控cyclin D1,将细胞周期阻断在G 0/G 1期,抑制survivin而增加cleaved caspase-3表达,增加细胞凋亡,继而使乳腺癌细胞MDA-MB231、MCF-7的增殖受到抑制。

槲皮素对人类乳腺癌细胞增殖的影响

目的观察槲皮素(Quercetin,Que)对人类乳腺癌细胞株增殖的影响。方法采用MTT法测定槲皮素对雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7和非雌激素依赖性乳腺癌细胞MDA-MB231细胞增殖作用,并以雌激素受体拮抗剂ICI182、780为工具药来评价槲皮素发挥雌激素样作用与雌激素受体(ER)的关系,采用流式细胞术对MCF-7细胞的增殖情况进行分析。结果与溶剂对照组相比较,Que(10～50μmol/L)能显著促进MCF-7细胞的增殖,而抑制ER阴性MDA-MB231细胞,并将MCF-7细胞周期由G1期向S期推进,促进DNA合成,提高细胞分裂增殖指数,且Que促进MCF-7细胞增殖作用被ER拮抗剂所拮抗。结论Que具有雌激素活性,此作用是通过ER介导的。

siRNA-SNCG增加乳腺癌细胞放射敏感性的实验研究

目的:研究siRNA-SNCG(Synuclein gamma)是否具有增加乳腺癌MDA-MB231细胞株放射敏感性的作用,并探讨可能卷入的分子机制。方法:siRNA特异性敲低MDA-MB231乳腺癌细胞中SNCG表达,使用CCK8细胞毒性实验、7AAD-A/PE-A凋亡实验和Western blot实验检测2 Gy放射作用下对细胞的生物学行为的影响。结果:siRNA特异性敲低SNCG蛋白表达显著增加2 Gy放射对MDA-MB231的细胞毒性和细胞凋亡。在siRNA-SNCG阳性转染组中,Bcl-2蛋白表达受到显著抑制,尤其是在联合放射的情况下,抑制作用更加显著(P<0.001)。结论:siRNA-SNCG通过降低Bcl-2表达来增加放射对MDA-MB231的细胞毒性和细胞凋亡,表明抑制SNCG表达具有增加乳腺癌肿瘤细胞放射敏感性的作用。

含表皮生长因子受体(EGFR)启动子萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌细胞模型的建立

目的建立稳定表达人表皮生长因子受体(EGFR)启动子及萤光素酶(Luc)报告基因的三阴性乳腺癌细胞系,并对其应用进行初步验证。方法采用基因重组技术,构建含有EGFR启动子以及Luc报告基因的慢病毒载体,并感染MDA-MB231细胞,经过嘌呤霉素筛选获得能稳定表达Luc活性的MDA-MB231-EGFR-Luc2细胞系;分别采用EGFR激活剂EGF以及抑制剂吉非替尼处理细胞后检测Luc活性变化。结果通过基因测序和质粒双酶切鉴定,EGFR基因启动子Luc报告基因-慢病毒表达载体构建成功,经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达Luc的MDA-MB231-EGFR-Luc2细胞;EGF可剂量依赖性的增加细胞中Luc的活性,而吉非替尼则相反。结论建立了MDA-MB231-EGFR-Luc2稳定表达EGFR启动子及Luc报告基因细胞系,为高通量筛选靶向EGFR的抗肿瘤药物提供一类新的细胞模型。

乳腺癌细胞中Rab7基因的克隆及序列分析

本实验主要是从人乳腺癌细胞中克隆Rab7基因并进行基因序列比对和分析。通过培养乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB231,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,以此cDNA为模板,根据GenBank公布的人Rab7全长序列设计引物,扩增Rab7基因的开放阅读框。将其与真核表达载体pc-DNA3.1连接,构建pcDNARab7重组质粒。测序后发现MCF-7细胞中克隆的Rab7序列与GenBank序列的同源性为91%,发生了多处突变,其中94.4%为同义突变,5.5%为错义突变。但是MDA-MB231细胞中克隆的Rab7基因序列与GenBank中的Rab7序列的同源性为100%。由于发现Rab7在MCF-7乳腺癌细胞中发生突变,而在MDA-MB-231乳腺癌细胞中基因未发生突变,我们推测Rab7基因的突变是否与乳腺癌的产生有关系,这个发现为以后研究Rab7与乳腺癌的关系奠定了基础。