不同MDCK单克隆细胞株对H5亚型禽流感病毒增殖条件和放大工艺的研究

为了解H5亚型禽流感病毒rFJ56株在MDCK全悬浮细胞上的增殖规律,确定100 L生物反应器工艺的最适接毒量和收获时间,对H5亚型禽流感病毒rFJ56株敏感的MDCK全悬浮细胞进行单克隆筛选和全悬浮驯化,筛选出对该毒株最敏感的MDCK单克隆细胞株;在摇瓶工艺的基础上,将该细胞在100 L生物反应器中接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,检测接种后不同时间病毒HA效价和病毒滴度(EID 50),确定最适接毒量和收获时间。共筛选出22株MDCK全悬浮细胞单克隆细胞株,其中5株对H5亚型禽流感病毒rFJ56株最敏感,接种后病毒HA效价均可达到9 log2;对MDCK单克隆细胞株按0.01%体积比接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,在100 L生物反应器中培养60 h,HA效价可达10 log2,病毒含量可达108.17 EID 50/0.1 mL,可为H5亚型禽流感病毒无血清全悬浮培养放大工艺提供参考。

抗黄曲霉毒素M_1的单克隆抗体细胞株的建立

本研究建立了抗黄曲霉毒素AFM1 的单克隆抗体细胞株。用AFM1-肟-牛血清白蛋白(AFM1 -oxim e-BSA)偶联物免疫Ba1b/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合,经3～4次亚克隆建立了3个稳定分泌抗黄曲霉毒素M1 抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3G2,3G3,6G8。3株抗体均属IgG1 亚类。培养上清液的稀释度为1v2 000～1v12 800,腹水的抗体稀释度为1v3.2×106 ～1v20×107,参考工作稀释度为1v1×106 ～1v2.5×106。3G3和6G8抗体的IgG 含量分别为0.8和1.43 g/L,亲和常数分别为5.438和4.369。

抗犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

[目的]筛选出稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]用纯化的犬瘟热病毒（CDV）抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和有限稀释法克隆杂交瘤细胞。研究了杂交瘤细胞的稳定性和染色体数,测定了单克隆抗体的效价并鉴定其特异性和亚型。[结果]经反复筛选和亚克隆后,共获得3株能稳定分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗对CDV均有较高的特异性,与犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒均不反应。3株杂交瘤细胞的腹水效价为1∶（8 000~128 000）,细胞培养上清效价为1∶（256~512）,染色体数为80~100。3株单克隆抗体重链均属于IgG1,轻链均属于κ链。[结论]该研究为研制CDV快速检测试剂盒奠定了基础。

抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为了获得稳定、高效分泌抗软骨藻酸(DA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用活泼酯法制备软骨藻酸免疫抗原(DA-KLH)和包被抗原(DA-BSA),以DA-KLH免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗软骨藻酸单克隆抗体杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备大量单抗,捕获EL ISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果显示,成功构建2株能稳定分泌DA单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株2B1和4C2,抗体亚类分别为IgG1和IgG2a,间接EL ISA检测小鼠腹水的抗体效价达1∶64 000,腹水纯化后蛋白浓度为1.27和0.675 mg/mL。研究结果表明,成功制备的抗DA单克隆抗体杂交瘤细胞株稳定、高效,为利用该单抗研制快速检测软骨藻酸的胶体金免疫层析试纸条打下基础。

己烯雌酚单克隆抗体细胞株的筛选及间接ELISA法的建立

以自行合成的己烯雌酚 (DES)免疫原免疫BALB/c小鼠 ,采用细胞融合、显微克隆等单克隆抗体技术 ,制备了 5株抗DES单克隆抗体分泌杂交瘤细胞株 (7B6、4B10、1G10、4E4、2C7) ;选择其中的 7B6株抗体 ,建立了间接竞争ELISA法 (indirectcompetitiveinhibitionELISA) ,通过初步优化 ,其检测限为 10 pg/孔 ,与同类二苯乙烯类雌激素的交叉反应高 ,而与天然雌激素雌二醇几乎无交叉反应性。这项研究为DES残留检测试剂盒的开发打下了基础。

抗丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

用丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心区合成肽作抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细节与骨髓瘤细胞ＳＰ＾２／０进行融合。经有限稀释法克隆３代后获得一株抗ＨＣＶ核心抗原ＣＰ１０的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株３Ｅ７，并对其分泌抗体进行初步鉴定。杂交瘤细胞培养上清的抗体滴度为１：３２０，诱生同系小鼠腹水的滴度为１：１２８００，该ＭｃＡｂ能与ＣＰ１０特异性结合，杂交瘤细胞染色体数目为１０６条。

抗人肝再生增强因子单克隆抗体对人肝癌细胞株HepG2增殖活性的影响

目的:检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达,利用hALR特异性的单克隆抗体(anti-hALR McAb)结合hALR,观察其阻断hALR的作用后,对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖活性的影响。方法:用免疫细胞化学以及RT-PCR的方法检测HepG2细胞hALR蛋白及mRNA的表达;用3H-TdR掺入法检测hALR特异性单克隆抗体中和hALR后HepG2细胞的增殖情况。结果:①HepG2细胞有hALR的表达。②抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后可部分抑制肿瘤细胞自主性生长。结论:抗hALR单克隆抗体能部分抑制肿瘤细胞自主性生长;hALR通过自分泌方式参与了肝癌细胞的自主性生长。

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的鉴定

筛选建立了 8株牛病毒性腹泻病毒 (BVDV )单克隆抗体杂交瘤细胞 ,通过对其染色体的分析、单克隆抗体免疫球蛋白类型及病毒中和活性等指标的检测 ,表明 8株单克隆抗体杂交瘤细胞的染色体数目均接近两亲本细胞的染色体数目之和 ;单克隆抗体免疫球蛋白类型均为IgG ,其中 6株为IgG1,2株为IgG2a ,且对BVDV具有不同程度的中和能力。

人心肌肌钙蛋白T单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的 :建立抗人心肌肌钙蛋白T(cTnT)单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株。方法 :从人心肌组织中提取纯化人cTnT ,免疫BALB/C小鼠 ,采用杂交瘤技术 ,间接ELISA法选择能稳定分泌抗cTnTMcAb的杂交瘤细胞株。结果 :建立了 2株稳定分泌抗cTnTMcAb的杂交瘤细胞株N15C和N16D ,其染色体数目为 90～ 10 6 ,McAbIg亚类均为IgG1,间接ELISA法测定McAb腹水效价分别为 1 80 0 0和 1 32 0 0 0。免疫印迹结果显示 2株McAb均可识别cTnT中Mr 为 370 0 0的单一区带 ,不识别人骨骼肌提取物。间接ELISA法测定N15C和N16DMcAb与cTnT反应的最低浓度分别为 4 7μg/L和 2 3μg/L。相加试验表明 2株McAb能识别不同的抗原表位。 结论 :获得

MDCK单克隆细胞库的建立及检定

目的:建立甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应MDCK单克隆细胞库,用于培养生产流感病毒疫苗,为细胞代替鸡胚制备流感病毒疫苗提供保证。方法:用有限稀释法将MDCK细胞进行单克隆化,通过血凝和TCID50筛选甲型H1N1流感病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株,扩大培养建立细胞库并进行检定。结果:共制备了97株单克隆化MDCK细胞,筛选到甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应性MDCK单克隆细胞株,扩大培养建立了细胞库,经检定符合《中华人民共和国药典.三部》(2010版)对细胞库的要求。结论:建立了甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应性MDCK单克隆细胞库,为细胞培养生产流感病毒疫苗奠定了基础。

米酵菌酸单克隆抗体细胞株的建立

继制备米酵菌酸（ＢＡ）多克隆抗体以后，作者成功地运用免疫杂交瘤技术，获得了能分泌抗米酵菌酸的单克隆抗体细胞株１Ｆ７和２Ｈ９，其腹水效价可达１０－６，对ＢＡ的５０％有效抑制浓度为１０－４，两株细胞分泌抗体的亚型均为ＩｇＧ１型。

识别血吸虫成虫多肽表位单克隆抗体细胞株的建立及用于检测循环抗原的研究

作者获得１株特异的抗血吸虫成虫２０－２４ｋＤａ蛋白多肽表位的杂交瘤细胞株（ＳｊＡ１１１）。分泌ＭｃＡｂ为ＩｇＧ１，腹水效价１．２×１０６。将ＳｊＡ１１１ＭｃＡｂ－ＨＲＰ结合物用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测４９９例慢性血吸虫病患者的循环抗原（ＣＡｇ），阳性者３９０例（７８．１６％）；２５例肺吸虫病人，３６例华支睾吸虫病人及１３２例正常人血清中，仅１例肺吸虫病人出现交叉反应。ＣＡｇ的检出率和阳性血清滴度倒数的几何均值（ＧＭＲＴ）随着每ｇ粪便虫卵数（ＥＰＧ）的增加而递增。吡喹酮治疗后各期病人粪孵阴性者ＣＡｇ的转阴率：半年为７５．５０％（１１４／５１），１年为７３．６８％（８４／１１４），１年半为８８．０４％（１０３／１１７）。

抗鸡IgG、抗鸭IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株的稳定性研究

抗鸡ＩｇＧ、抗鸭ＩｇＧ单克隆抗体杂交瘤细胞株的稳定性研究张春红伍惠卿杜伟贤黄忠（广东省农业科学院兽医研究所，广州５１０６４０）自１９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ首次利用Ｂ淋巴细胞杂交瘤技术生产单克隆抗体（ＭｃＡｂ）以来，为所有需要制备和使用抗...

睾酮单克隆杂交瘤细胞株的筛选及性能鉴定

为建立大批量样品中睾酮残留的检测方法,采用细胞融合技术、间接ELISA和间接竞争ELISA(icELISA)等方法,对睾酮单克隆杂交瘤细胞株进行了筛选及性能鉴定。结果表明:筛选出5株(T2C3,T2D9,T3A5,T4B1、T4E8)杂交瘤细胞,抗体亚类均为IgG1型,具k轻链,亲和常数为4.38×108～5.24×109 L/mol;腹水纯化后的抗体效价和灵敏度(IC50)分别为0.64×105～2.56×105和1.58～2.92ng/mL。以T2D9细胞株建立icELISA标准曲线,其线性范围为0.06～63.5ng/mL,检测限和IC50值分别为0.04和1.55ng/mL。

人促甲状腺激素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以进口纯人促甲状腺激素（ｈ—ＴＳＨ）作免疫原，经用Ｇａｌｆｒｅ等杂交瘤制备法，分别制备成１３Ｂ４、１３Ｃ４、８Ｈ１０、３Ｅ４四株具有抗ｈ—ＴＳＨ特异性，与促黄体素、促卵泡素、绒毛膜促性腺素无明显交叉反应。具有稳定分泌功能的杂交细胞株。经亚型鉴定均为ＩｇＧ１。液相中与１２５Ｉ—ｈＴＳＨ的最大结合率依次为１３Ｂ４、３Ｅ４、８Ｈ１０和１３Ｃ４，分别为６１％、５９％、５６％和３４％。表位分析表明，４株单抗主要针对两个不同表位。在此基础上已成功地建立ｈ—ＴＳＨ固相免放和酶免吸附超敏测定法。

新疆出血热北疆株单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

作者应用新疆出血热病毒北疆株９０－９株鼠脑免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，共获得４株分泌抗ＸＨＦＶ北疆株单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞系。核型分析表明符合杂交瘤细胞的标准。用间接免疫荧光法及间接酶联免疫吸附试验检测表明，ＭｃＡｂ的腹水具有很高滴度，其中２株可达５×１０５（ＥＬＩＳＡＰ／Ｎ≥２．１）。ＭｃＡｂ免疫球蛋白亚型鉴定均属ＩｇＧ，其中３株为ＩｓＧ１，１株为ＩｇＧ２ａ。对ＭｃＡｂ的初步应用表明，在反向被动血凝抑制试验（ＲＰＨＩ）中，分别采用南、北疆ＭｃＡｂ致敏血球检测小鼠腹水，其结果有明显差异。

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术获得了1株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞2D6。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,诱生腹水抗体效价达1∶6×104,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗原之间均无交叉反应;ELISA阻断试验表明,TGEV特异性阳性血清对TGEV-McAb有明显的阻断作用,该McAb所识别的抗原是TGEV所特有的抗原决定基。

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN 1 株,用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞并与NS0 骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,3次有限稀释法克隆,得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株:3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定,3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类,3C11株为IgG2a亚类;杂交瘤细胞的平均染色体数目为99 条。3A8、3C7、3E9、3C11 与BCV、BRV均无交叉反应,但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应,而3C11与HCV、BDV无交叉反应,3C11显示出较好的特异性;杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1∶1 000 和1∶200 000,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。

分泌抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将猪细小病毒(PPV)免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP_2/O细胞在聚乙二醇作用下融合,用血凝抑制试验(HI)筛选,以有限稀释法克隆3次,得到5株分泌抗PPV单克隆抗体(McAb),选择抗体分泌较高的4F_4、A_4或E_8进行较详细的研究,结果表明,其核内染色体数为93和87,抗体属性为IgG_1,其中1株为K轻链,用交叉HI法对2株McAb作特异性分析,该McAb只特异地与PPV发生反应,而不与日本乙型脑炎(JEV)、犬细小病毒(CPV-b)发生反应,将其中3株杂交瘤细胞注射BALB/C小鼠,抗体HI效价介于1:256～1:10240之间。