MDCK细胞悬浮培养技术在流感疫苗中的应用

介绍了国内外MDCK细胞悬浮培养技术的工业化发展现状,通过对比,总结了MDCK细胞生产流感疫苗的优点,详细阐述了流感疫苗MDCK细胞悬浮培养的关键技术,分析了流感疫苗生产用MDCK细胞的致瘤性;随着现代生物技术的发展,利用细胞悬浮培养技术进行疫苗生产是生物制药行业发展的必然趋势,流感疫苗MDCK细胞无血清悬浮培养技术的研究具有跨时代的意义。

流感疫苗生产用MDCK细胞悬浮培养技术研究进展

传统的流感病毒疫苗生产多采用鸡胚培养工艺,这种方法一直沿用至今,然而这种生产工艺受到许多限制：鸡胚来源受限;培养过程极易污染;成本不易降低;不能保证产品的质量稳定性等。而在未来几年,随着对流行性和季节性流感疫苗的需求越来越大,人们会迫切选择使用低成本质量高的疫苗,这也就使得以细胞培养技术生产流感疫苗成为趋势,

MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感疫苗研究与生产中的应用进展

流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段。MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产。随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术。通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性。总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具。同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性。

基于悬浮型MDCK细胞冻存和快速复苏的一种流感病毒培养方法

本文使用一种基于高分子聚合物的细胞保护剂(CCM046)冻存和复苏悬浮型MDCK细胞,并探索开发一种更加便捷的流感病毒培养方法。结果显示,CCM046细胞冻存液可稳定的于-80℃条件下保存悬浮型MDCK细胞,且细胞活力稳定,可在复苏后快速恢复细胞增殖。在细胞复苏24 h后进行攻毒实验,培养48 h后所产生的流感病毒含量基本与持续培养的新鲜细胞相同,初步证明该方法可用于建立一种快速、便捷的使用MDCK细胞培养和分离流感病毒的技术方法。

粉防己组织培养体系的建立和细胞悬浮培养初探

为促进粉防己的资源保护和利用,以茎段和愈伤组织为材料建立植物组织培养体系,并利用愈伤组织细胞进行悬浮培养。结果表明,以茎段为外植体直接分化不定芽的最佳培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L,60 d不定芽诱导率为100%,单个外植体分化不定芽数16个,90 d时分化数可达28个,该配方同时适用于诱导愈伤组织分化不定芽;不定芽生根以培养基MS+IAA 0.2 mg/L为佳,30 d的生根率达92.5%,平均主根长7.78 cm,炼苗移栽15 d的成活率达88.00%;利用愈伤组织细胞进行悬浮培养,可在较短的培养周期获得可观的生物积累量,干培养物提取液生物碱定性检测为阳性。

LMH贴壁细胞悬浮驯化及其在新城疫病毒培养工艺中的应用

为建立鸡新城疫病毒La Sota株在LMH细胞上的全悬浮培养工艺,以获得高滴度的新城疫疫苗抗原,采用LMH贴壁细胞悬浮培养驯化方法,获得了形态良好、能稳定传代的LMH悬浮细胞株;以LMH悬浮细胞在摇瓶培养NDV La Sota株为基础,对接毒细胞密度、接毒剂量、胰酶添加浓度、收获时间等工艺参数进行了摸索和优化,并在14 L生物反应器中进一步进行3个批次的培养验证。结果显示:LMH悬浮细胞以初始密度1.5×10^(6)/mL左右接种,培养72 h可增殖到8.0×10^(6)~9.0×10^(6)/mL,细胞活率达97%以上。确定NDV La Sota株在LMH悬浮细胞株上的培养工艺:LMH细胞悬浮培养至不低于4.5×10^(6)/mL按照感染复数不低于0.2接种病毒,并添加终浓度为5μg/mL的胰酶,于37℃培养72 h左右,细胞活率在30%左右收获病毒液,NDV HA均可达1∶2048~1∶4096,病毒含量≥10^(7.63)EID50/0.1 mL。结果表明成功建立了LMH细胞全悬浮培养工艺,并能在生物反应器扩大培养,为ND相关疫苗研发提供了技术支撑。

百岁兰愈伤的诱导与悬浮细胞培养

为探究稳定高效的百岁兰叶片愈伤组织诱导体系及其悬浮细胞培养方法,利用百岁兰叶片作为材料,采用正交法使用两种激素(NAA与6-BA)配置植物培养基,运用避光与昼夜节律两种处理诱导愈伤组织产生,并利用愈伤组织与其对应配比的液体培养基培养悬浮细胞。结果表明,百岁兰叶片在0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA浓度下的诱导愈伤具有最好的稳定性与成功率,在昼夜节律条件下诱导与生长的效率很高,以此为基础培养的悬浮细胞取得了一定进展。研究可为百岁兰的保护与稳定遗传提供技术参考。

全悬浮培养ST细胞增殖猪瘟兔化弱毒株的工艺研究

本试验利用生物反应器对ST细胞全悬浮培养参数以及猪瘟病毒的繁殖工艺进行探索。从培养基、细胞接种浓度、病毒接毒量三个方面进行工艺优化,放大培养,建立了猪瘟病毒的全悬浮培养工艺。结果表明:当细胞接种浓度为1.0×10^(6)/mL、病毒接毒MOI为0.05、采用培养基1进行培养时,病毒含量达到10^(7.5)FAID_(50)/mL,工艺验证两次,结果都符合要求,稳定可靠,为猪瘟疫苗大规模全悬浮培养奠定了基础。

基于生物反应器的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)悬浮培养工艺研究

为了优化生物反应器全悬浮培养技术制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,试验首先通过摇瓶培养对病毒接种时的细胞密度、胰酶浓度、接毒剂量和收毒时间等培养条件进行优化;之后按照摇瓶培养确认的工艺进行生物反应器全悬浮培养工艺验证,同时对pH值、溶氧值(DO)、转速等培养参数进行优化,以病毒含量(TCID_(50))为指标,最终筛选出在15L生物反应器中培养猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的最优条件,并进一步在50L生物反应器中进行工艺验证,将病毒液灭活后稀释至1×10^(7).0TCID_(50)/mL免疫怀孕75~90d的健康易感初怀母猪,在分娩当日,采集母猪和仔猪血清,并对分娩的3日龄仔猪攻毒进行免疫原性试验。结果表明:猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在摇瓶上的最适培养条件为当细胞密度达到6×10^(6)个/mL以上时,用含胰酶(终浓度为20μg/mL)的无血清培养基将细胞密度稀释至2×10^(6)个/mL,按感染复数(MOI)=0.1接毒,130 r/min摇床振荡培养36h可收获病毒液,病毒含量可稳定达到1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在15L生物反应器上的最适培养条件为pH值7.0~7.2、DO值50%、转速80~100 r/min,培养36h收获的病毒液含量可稳定在1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;在50L生物反应器上放大培养收获的病毒液含量为1×10^(7).8TCID_(50)/mL。母猪和仔猪中和抗体效价均≥1∶32,免疫保护力为100%。说明本试验条件下成功建立并优化了生物反应器全悬浮培养制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,生产的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的免疫原性较好。

显齿蛇葡萄叶细胞悬浮培养体系的建立及其产多酚类物质研究

显齿蛇葡萄叶富含多酚类化合物,是一种具有很高开发利用价值的新资源食品原料。以显齿蛇葡萄幼叶为外植体诱导出了2种典型的愈伤组织,通过激素优化和连续筛选获得了性状优良的愈伤组织,在此基础上建立并优化了显齿蛇葡萄叶细胞悬浮培养体系,对悬浮培养细胞中的主要多酚类物质进行了鉴定,并评价了多酚的抗氧化活性。采用超高压液相色谱飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS/MS)和高效液相色谱(HLPC)检测技术,分别从愈伤组织和悬浮培养细胞中鉴定出了7种和10种多酚类化合物,其中原花青素B1、(+)-儿茶素、表儿茶素没食子酸酯为愈伤组织和悬浮培养细胞中共有的物质,且含量较高,其中以表儿茶素没食子酸酯含量最高,在愈伤组织和悬浮培养细胞中分别达到了5 020.965μg/g和1 044.725μg/g。抗氧化活性评价结果显示,悬浮培养细胞多酚提取物具有很强的抗氧化活性,对2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)和2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基清除的IC50分别为30.681μg/mL和3.685μg/mL,相同质量浓度下对DPPH自由基的清除和总还原能力均强于维生素C,其抗氧化能力主要源于表儿茶素没食子酸酯和(+)-儿茶素。希望研究可为显齿蛇葡萄细胞培养及其多酚类次生代谢产物的合成调控提供参考。

F81细胞无血清悬浮驯化后培养猫泛白细胞减少症病毒的研究

为解决国内猫泛白细胞减少症生物制品短缺的问题,筛选出适用于猫泛白细胞减少症病毒增殖的猫肾细胞系(F81),通过对贴壁F81进行降血清悬浮驯化培养,得到了无血清全悬浮培养F81细胞系。研究建立的F81细胞系在初始传代细胞密度为1×10^(6)cells/mL时,培养48 h后细胞密度可达到7.02×10^(6)cells/mL。对培养猫泛白细胞减少症病毒工艺进行摸索,确定最佳接毒工艺为同步接毒法,初始接毒细胞密度为1×10^(6)cells/mL、MOI为3.5×10^(-2),培养72 h后收毒,病毒滴度可达到10^(7.25)TCID_(50)/0.1 mL。该方法使用同源细胞系且未添加动物血清,为猫泛白细胞减少症生物制品生产降低了下游生产纯化难度,同时降低了生产成本,可显著提高产品核心竞争力。研究结果可为其他猫用生物制品相关研究提供参考。

悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗免疫剂量试验

为研究由悬浮培养的MDCK细胞制备的H9亚型AIV抗原所制备的灭活疫苗的免疫剂量,在生物反应器中悬浮培养MDCK细胞,接种H9亚型禽流感病毒WD98和HN04种毒,收获抗原液,以2种抗原液分别制备2个毒株的单价油佐剂灭活疫苗。每种疫苗均按照0.3、0.2、0.1、0.05mL/只（107.5 EID50/只~105.52 EID50/只）的剂量接种21日龄SPF鸡,免疫接种后3周采血测定AIV的HI抗体,采血后分别用与制苗株同源的H9亚型AIV种毒静脉注射攻毒,测定疫苗保护率。2种疫苗不同剂量免疫接种后21d的AIV HI抗体水平达到3.8log2~5.6log2,对照组鸡AIV HI抗体均为0log2。攻毒试验证实,以105.52 EID50/只~107.5 EID50/只剂量进行免疫接种,免疫鸡只获得了80%以上的保护。按照兽药典H9亚型禽流感疫苗攻毒保护率90%为合格的标准,悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的最小免疫接种剂量为106.82 EID50/只。

兔垂体干细胞的培养鉴定及分化

背景:脑垂体是人体重要的内分泌器官。多种疾病可引起脑垂体损伤,如脑垂体瘤、垂体功能减退症等。垂体干细胞因具有自我更新和多向分化潜力的特性,有望成为一种新的治疗方式修复受损的垂体。目的:采用悬浮细胞球培养法分离培养垂体干细胞,鉴定其增殖及分化能力。方法:采用悬浮细胞球培养法从新生新西兰白兔垂体中分离培养垂体干细胞,观察其形态特征;免疫荧光细胞染色检测垂体干细胞标志蛋白SOX2及Nestin的表达;采用EdU标记法检测垂体干细胞增殖能力;经贴壁及诱导分化后,通过ELISA法检测培养基中的激素水平。结果与结论:通过悬浮细胞球培养法可成功分离得到垂体干细胞球,且具有较强的增殖能力;干细胞特异性标记物SOX2和Nestin阳性表达;经诱导分化后培养基中促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促生长激素、促黄体生成激素、促卵泡素、催乳素水平显著升高(P<0.001),具有较强的分化能力。

外源诱导子和温度对黑果枸杞悬浮细胞花青素积累的影响

黑果枸杞富含花青素,是一种具有很高开发利用价值的药食同源植物。以黑果枸杞无菌苗的叶片为外植体诱导愈伤组织建立细胞悬浮体系,研究不同外源激素和温度对黑果枸杞悬浮细胞中花青素含量的影响。黑果枸杞愈伤组织诱导的最佳培养体系为WPM+0.5 mg/L激动素+2.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂,悬浮细胞培养的最优体系为WPM+0.5 mg/L激动素+2.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+0.01 mg/L萘乙酸+20.0 g/L蔗糖,其生长曲线呈“S”形,活细胞数量在悬浮培养第18天时达到峰值,为7.93×10^(5)个/mL。30 g/L蔗糖、200 mg/L茉莉酸甲酯、2 mg/L脱落酸及16℃单一处理均能显著促进悬浮细胞花青素产量的提升(P<0.05),2 mg/L脱落酸诱导效果最佳。在16℃和3种外源激素的复合处理下,200 mg/L茉莉酸甲酯+16℃的复合诱导处理能显著促进细胞花青素积累(P<0.05),含量是16℃单因素处理的1.13倍。研究结果为进一步优化黑果枸杞悬浮细胞培养体系、促进花青素积累奠定了基础。

L929细胞无血清悬浮驯化及其在流产衣原体灭活疫苗中的应用研究

为通过悬浮细胞培养方法规模化生产流产衣原体抗原,采用逐步降血清悬浮驯化法使贴壁L929细胞逐步适应悬浮培养环境,最终获得了一株可无血清悬浮培养的L929细胞株。将流产衣原体接种于L929悬浮细胞上,研究不同的促感染试剂以提高收菌量,并选择出最佳的培养方法制备流产衣原体灭活疫苗。以25μL、50μL、100μL的剂量免疫Balb/c小鼠,攻毒后检测其免疫保护效果。结果显示,当该L929悬浮细胞初始接种密度为5×10^(5)/mL时,培养72 h后细胞浓度可达到约7×10^(6)/mL,细胞活力在95%以上;在细胞密度为6×10^(6)/mL,接菌量为5.5×10^(4) IFU/mL,加入脂质体2000的量为1.7μL/mL、放线菌酮浓度为0.4μg/mL时,菌量增殖倍数最大,48 h内约扩增了52倍。经流产衣原体悬浮培养细胞灭活疫苗免疫后,小鼠产生的抗体水平随免疫剂量的增加而提升;接种50μL、100μL疫苗组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、IFN-γ、IL-2的含量远高于接种25μL疫苗和注射PBS组的小鼠;对免疫后的小鼠进行攻毒,接种疫苗组小鼠的脾脏、十二指肠、子宫中的流产衣原体基因组含量远低于未接种疫苗组小鼠。注射PBS组及接种25μL疫苗组的小鼠子宫出现了不同程度的坏死及炎症,而其余两组小鼠的子宫无异常变化。结果表明,本试验成功驯化出1株L929悬浮培养细胞株,并且通过悬浮培养工艺制备的流产衣原体灭活疫苗免疫效果良好,接种50μL、100μL该灭活疫苗可以有效抑制流产衣原体的感染,该L929细胞全悬浮培养株的成功驯化为疫苗规模化生产提供了技术支持。

灵芝诱导子对南方红豆杉悬浮培养细胞产紫杉醇的影响

为提高红豆杉悬浮细胞紫杉醇产量,采用制备的灵芝(Ganoderma lucidum)诱导子处理南方红豆杉(Taxus wallichiana var.mairei)悬浮细胞,通过分析细胞生长量、紫杉醇总产量,研究灵芝诱导子对红豆杉悬浮细胞的影响。结果表明,灵芝诱导子添加质量浓度为100µg/mL时,红豆杉悬浮细胞生长指数和紫杉醇总产量显著高于其他质量浓度(P<0.05),该质量浓度为灵芝诱导子的最佳添加质量浓度;灵芝诱导子在细胞生长的第8天加入时,第21天的细胞生长指数和紫杉醇总产量显著高于其他添加时间(P<0.05),细胞生长的第8天为灵芝诱导子的最佳添加时间;灵芝诱导子持续作用6 d时,细胞生长指数和紫杉醇总产量显著高于其他持续作用时间(P<0.05),该持续作用时间为灵芝诱导子的最佳持续作用时间。在悬浮细胞培养的第8天加入100µg/mL灵芝诱导子培养至第21天时,细胞干质量和紫杉醇总产量达到峰值,分别为对照(等量蒸馏水处理)的221.13%、569.69%;细胞膜表面黏膜和球状物质增加;苯丙氨酸解氨酶活性和总酚含量提高,细胞活力和多酚氧化酶活性降低。

无血清悬浮球状培养方法在人源前列腺癌干细胞富集纯化中的应用

目的:通过无血清悬浮球状培养方法富集纯化人源前列腺癌干细胞并进行小鼠体内外实验验证。方法:采用前列腺癌DU145细胞系,通过无血清悬浮球状培养的方法分离富集、培养纯化出肿瘤干细胞微球(Tumor spheres)。通过流式细胞仪鉴定干细胞表型,并采用动物成瘤实验,将不同数量级的DU145细胞和Tumor spheres细胞接种到NOD/SCID小鼠双侧腋下,观察成瘤率和成瘤速度。对分离富集、培养纯化的Tumor spheres进行诱导分化、增殖水平、活性氧簇、细胞周期检测。为进一步明确Tumor spheres的肿瘤干细胞特性,采用Western blot法检测特异性蛋白的表达,RT-PCR法检测相关mRNA表达。结果:采用无血清悬浮球状培养的方法可使对数生长期DU145细胞分离富集形成Tumor spheres,培养3代可达到纯化的目的,流式细胞技术鉴定其表达前列腺癌干细胞表型CD44(+)CD24(-/low)比例为(63±1)%,明显高于DU145细胞[(33±4)%](P<0.05)。动物成瘤实验显示,接种Tumor spheres侧肿瘤成瘤速度和成瘤率均高于接种DU145细胞侧。Tumor spheres具有更强的自我更新能力和分化潜能,细胞周期检测发现Tumor spheres中(81.67±0.68)%处于细胞周期的G_(0)/G_(1)期(P<0.05),同时Tumor spheres具有更低水平的活性氧簇ROS水平(P<0.05)。Tumor spheres高表达肿瘤干细胞HES1蛋白(P<0.05),Tumor spheres高表达肿瘤干细胞相关Notch1、HES1、HIF-1α、Sox2、Jagged1的mRNA(P<0.05)。结论:无血清悬浮球培养分离纯化DU145肿瘤干细胞的方法简便易行、获取量大、成瘤率高,Tumor spheres具有明确的肿瘤干细胞特性,可作为前列腺癌肿瘤干细胞研究的良好实验模型。

月季细胞悬浮培养研究进展与前瞻

细胞悬浮培养技术作为植物生物技术研究的新热点,不仅可以直接用于原生质体分离、培养与杂交,还可以胚性细胞悬浮系为受体材料用于遗传转化并获得转基因植株。该研究聚焦于月季新品种的选育,以新途径为月季转基因试验提供优良受体材料为宗旨,通过借鉴其他植物细胞悬浮培养技术的经验,详细分析、归纳了影响植物细胞悬浮培养过程的主要因素并探讨将其应用于月季悬浮细胞系的可能性进行前瞻性分析与推测,为月季建立稳定的细胞悬浮体系和月季遗传改良工作提供参考依据,并对月季细胞悬浮培养应用前景进行了展望。

犬新孢子虫Nc-1株在MDBK、Vero和MDCK细胞中的培养比较

为了分析新孢子虫在3种不同宿主细胞内的生长情况,该试验采用犬新孢子虫Nc-1株,将其与牛肾细胞(MDBK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)和犬肾上皮细胞(MDCK)在37℃条件下培养10 d,每天观察比较3种细胞在虫体入侵前后的形态变化并记录虫体数量,绘制虫体生长曲线。结果表明:犬新孢子虫Nc-1株在MDBK、Vero和MDCK细胞中均能够正常生长。其中,Nc-1株在入侵Vero细胞的第6天可以较快达到生长高峰期,而在MDBK和MDCK细胞中生长较慢,在第7天才能达到虫体数量的最大值,且MDCK细胞中虫体数量最少。因此,除Vero细胞外,MDBK细胞也可作为一种培养新孢子虫良好的细胞系。该试验为深入了解新孢子虫感染机制和选择合适的体外培养模型提供重要参考。