MDPV和MDGPV母源抗体对MDPV-MDGPV二联活疫苗抗体水平影响的研究

为明确番鸭细小病毒(MDPV)和番鸭小鹅瘟病毒(MDGPV)母源抗体对免疫MDPV-MDGPV二联活疫苗(下称“二联活疫苗”)番鸭抗体水平的影响,本研究将二联活疫苗分别免疫1日龄不同母源抗体水平的雏番鸭,并设非免疫对照组,分别于免疫前和免疫后不同时间点连同非免疫对照组同时采血,采用乳胶凝集抑制试验(LPAI)分别测定各组雏番鸭血清中MDPV LPAI和MDGPV LPAI抗体效价。并按雏番鸭母源抗体高低分组即:MDPV母源抗体阴性组(<1 log2,A组)、MDPV低母源抗体组(1 log2~3 log2,B组)、MDPV高母源抗体组(4 log2~6 log2,C组)、MDGPV母源抗体阴性组(<1 log2,D组)、MDGPV低母源抗体组(1 log2~3 log2,E组)和MDGPV高母源抗体组(4 log2~6 log2,F组),根据LPAI抗体检测结果分析各免疫组抗体水平变化和非免疫对照组母源抗体消长规律。结果显示:免疫二联活疫苗均可诱导1日龄雏番鸭产生不同水平的LPAI抗体,免疫后7 d(7 dpi)MDPV LPAI和MDGPV LPAI抗体均100%阳性,随后逐渐升高至28 dpi达峰值;其中,7 dpi~28 dpi母源抗体阴性组(A组和D组)的MDPV LPAI和MDGPV LPAI抗体快速升高且明显高于母源抗体阳性组(B组、C组、E组和F组);1 dpi~5 dpi母源抗体阳性组(B组、C组、E组和F组)因母源抗体未衰减,其MDPV LPAI和MDGPV LPAI效价均高于母源抗体阴性组(A组和D组)。非免疫对照组番鸭母源抗体消长分析结果显示不同母源抗体衰减期存在差异,随着日龄增长母源抗体逐渐下降,低母源抗体组(1 log2~3 log2)和高母源抗体组(4 log2~6 log2)分别在8日龄和15日龄时均有80%左右番鸭MDPV LPAI和MDGPV LPAI抗体转为阴性。上述结果表明低母源抗体对1日龄雏番鸭二联活疫苗抗体的产生无明显影响,而高母源抗体对番鸭抗体峰值有一定影响,建议高母源抗体雏番鸭可适当推迟至5日龄免疫。本研究为该二联活疫苗免疫程序的制定提供了科学依据。

番鸭小鹅瘟弱毒D株NS蛋白抗原位点特征分析

为获得番鸭小鹅瘟病毒弱毒株(MDGPV-D)非结构蛋白NS基因的相关信息,根据已发表的MDGPV-PT株全基因序列,应用DNAStar分子生物学软件设计1对引物,采用高保真PCR技术扩增MDGPV-D株NS全基因序列。对番鸭小鹅瘟病毒疫苗弱毒D株(MDGPV-D)NS基因进行克隆、测序,并利用生物信息学技术分析MDGPV-D株NS蛋白的同源性、遗传衍化、N-糖基化位点、磷酸化位点、B细胞抗原表位、T细胞抗原表位及其二级结构。结果表明,D株NS全基因大小为1 884bp,编码627个氨基酸(GenBank登录号:JF926696),与MDPV NS基因的亲缘性最近核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为97.9%～98.6%,97.6%～98.2%;MDGPV-D株NS蛋白具有3个潜在的N-糖基化位点和27个磷酸化位点,可能存在11个B细胞抗原表位,13个CD8+CTL表位,10个CD4+Th抗原表位;二级结构分析显示,α螺旋和无规则卷曲含量高,分别为40.67%、41.15%,而β转角仅占4.63%。与亲本强毒PT株相比,弱毒D株的NS蛋白存在2个定点突变,分别位于核苷三磷酸区域(第338位氨基酸)与CD4+Th抗原表位(第225位氨基酸)。

番鸭小鹅瘟病毒PT分离株全长DNA克隆的构建

为构建番鸭小鹅瘟病毒感染性克隆,进行水禽细小病毒基因组结构及功能研究,根据NCBI发表的GPV B株、MDPV FM株与MDGPV PT株核苷酸序列设计并合成了MDGPV特异性引物,进而应用PCR技术分4段扩增并克隆了覆盖MDGPV全长基因组的4个片段。经过拼接与测序,将MDGPV全长DNA定向克隆到质粒pBluescriptⅡKS(+)中,获得了MDGPV PT株全长基因组DNA克隆pSK-PT1234。与MDGPV亲本PT株及NCBI登录的其他水禽细小病毒代表株序列比对发现,该克隆在NS与VP编码区间隔处存在人为引入Bsp1407Ⅰ酶切位点。番鸭小鹅瘟病毒PT株全长DNA克隆成功构建,为下一步病毒的拯救奠定坚实的基础。