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利用CRISPR/Cas9技术构建MDH2敲除细胞株及抗呕吐毒素效应研究
1
作者
施炜涛
姚春鹏
+7 位作者
魏文康
王蕾
房元杰
仝钰洁
马晓姣
蒋文
张晓爱
邵伟
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第7期307-315,共9页
试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除苹果酸脱氢酶2(malate dehydrogenase 2,MDH2)基因的IPEC-J2单克隆细胞株,并研究敲除MDH2基因后抗呕吐毒素效应。针对MDH2基因序列设计sgRNA插入PX459载体中,构建PX459-sgRNA-MDH2重组...
试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除苹果酸脱氢酶2(malate dehydrogenase 2,MDH2)基因的IPEC-J2单克隆细胞株,并研究敲除MDH2基因后抗呕吐毒素效应。针对MDH2基因序列设计sgRNA插入PX459载体中,构建PX459-sgRNA-MDH2重组质粒;将质粒通过电转导入IPEC-J2细胞中,并加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型测序鉴定、荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证,获得MDH2基因敲除的单克隆细胞株;最后通过CCK8试剂盒和细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测细胞存活情况,测定MDH2敲除细胞株对呕吐毒素的抗性。测序结果显示MDH2基因敲除载体构建成功。利用荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法验证了获得的细胞系为MDH2基因敲除的单克隆细胞株。CCK8细胞活力实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除MDH2可使IPEC-J2细胞在不同浓度呕吐毒素(4、2、1和0.5μg/mL)处理5 d时细胞活力分别极显著提高18.67%、19.59%、26.36%和27.01%。流式细胞仪实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除MDH2使不同浓度呕吐毒素处理5 d的细胞死亡率分别极显著降低30.33%、15.81%、16.00%和14.70%。利用CRISPR/Cas9系统对IPEC-J2细胞中的MDH2基因进行敲除并筛选获得了MDH2-KO单克隆细胞株,并通过细胞活力和细胞死亡检测,证明该细胞株具有抗呕吐毒素毒性效应的效果,为揭示呕吐毒素诱导宿主细胞死亡的毒性机制提供借鉴,为防治呕吐毒素提供新策略。
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关键词
CRISPR/Cas9系统
呕吐毒素
mdh2
基因
细胞存活
细胞死亡
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职称材料
题名
利用CRISPR/Cas9技术构建MDH2敲除细胞株及抗呕吐毒素效应研究
1
作者
施炜涛
姚春鹏
魏文康
王蕾
房元杰
仝钰洁
马晓姣
蒋文
张晓爱
邵伟
机构
新疆农业大学动物科学学院
广东省农业科学院农业生物基因研究中心广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室
广东省农业科学院蔬菜研究所广东省蔬菜新技术研究重点实验室
出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第7期307-315,共9页
基金
国家自然科学基金项目(31872127,32002287)
广东省农科院学科团队项目(202110TD,202131TD)。
文摘
试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除苹果酸脱氢酶2(malate dehydrogenase 2,MDH2)基因的IPEC-J2单克隆细胞株,并研究敲除MDH2基因后抗呕吐毒素效应。针对MDH2基因序列设计sgRNA插入PX459载体中,构建PX459-sgRNA-MDH2重组质粒;将质粒通过电转导入IPEC-J2细胞中,并加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型测序鉴定、荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证,获得MDH2基因敲除的单克隆细胞株;最后通过CCK8试剂盒和细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测细胞存活情况,测定MDH2敲除细胞株对呕吐毒素的抗性。测序结果显示MDH2基因敲除载体构建成功。利用荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法验证了获得的细胞系为MDH2基因敲除的单克隆细胞株。CCK8细胞活力实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除MDH2可使IPEC-J2细胞在不同浓度呕吐毒素(4、2、1和0.5μg/mL)处理5 d时细胞活力分别极显著提高18.67%、19.59%、26.36%和27.01%。流式细胞仪实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除MDH2使不同浓度呕吐毒素处理5 d的细胞死亡率分别极显著降低30.33%、15.81%、16.00%和14.70%。利用CRISPR/Cas9系统对IPEC-J2细胞中的MDH2基因进行敲除并筛选获得了MDH2-KO单克隆细胞株,并通过细胞活力和细胞死亡检测,证明该细胞株具有抗呕吐毒素毒性效应的效果,为揭示呕吐毒素诱导宿主细胞死亡的毒性机制提供借鉴,为防治呕吐毒素提供新策略。
关键词
CRISPR/Cas9系统
呕吐毒素
mdh2
基因
细胞存活
细胞死亡
Keywords
CRISPR/Cas9 system
deoxynivalenol
mdh2 gene
cell survival
cell death
分类号
S859.8 [农业科学—临床兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
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被引量
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1
利用CRISPR/Cas9技术构建MDH2敲除细胞株及抗呕吐毒素效应研究
施炜涛
姚春鹏
魏文康
王蕾
房元杰
仝钰洁
马晓姣
蒋文
张晓爱
邵伟
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2023
0
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职称材料
已选择
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