mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响

旨在研究马立克病病毒(Marek′s disease virus,MDV)编码的mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响,将mdv1-miR-M4-5p模拟物、抑制物及其阴性对照转染MDCC-MSB1细胞后48 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2以及caspase-9、caspase-3、cyt-c、cyclinD1、Bcl-2等增殖和凋亡相关分子的转录;CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果显示:与对照组相比,mdv1-miR-M4-5p模拟物转染显著上调MDCC-MSB1细胞中mdv1-miR-M4-5p、cyclinD1、Bcl-2的转录水平,下调TGF-β1、Smad2、cyt-c、caspase-9和caspase-3的表达转录,促进细胞的增殖,减少G1期细胞,增加S和G2细胞,降低细胞凋亡率。与对照组相比,mdv1-miR-M4-5p抑制物转染后MDCC-MSB1细胞的增殖、凋亡及其相关分子转录的结果与mdv1-miR-M4-5p模拟物转染后的结果相反。综上,Mdv1-miR-M4-5p可促进MDCC-MSB1细胞增殖,抑制其凋亡,这可能是通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路来实现的。

重组酵母鸡α干扰素的诱导表达及其抗MDV、NDV能力

【目的】获得鸡α干扰素重组酵母菌诱导表达的最佳诱导时间和甲醇的体积分数,并测定诱导表达产物对鸡马立克氏病毒(MDV)和鸡新城疫病毒(NDV)的抑制能力。【方法】挑取2个鸡α干扰素重组酵母菌单菌落至BMGY培养基中培养,待菌液OD600为4左右时,分别转接至BMMY培养液诱导,1瓶每隔12 h补加1次体积分数0.5%甲醇,另1瓶每隔12 h补加1次体积分数1%甲醇,于24,48,72 h收集样品,备SDS-PAGE检测用。根据不同时间(24,48,72,96 h)诱导上清液表达量的差异,留用表达量最高时段的上清液,经初步纯化后,利用鸡胚成纤维细胞(CEF),分别测定重组酵母鸡α干扰素抑制MDV及NDV的能力。【结果】鸡α干扰素重组酵母菌在每隔12 h补加1次体积分数1%甲醇诱导48 h时,或每隔12 h补加1次体积分数0.5%甲醇诱导72 h时,重组酵母鸡α干扰素表达量均达到最高;且诱导上清液具有较好地抑制MDV、NDV的能力。【结论】获得了鸡α干扰素重组酵母菌小量发酵的最佳条件;获得的重组酵母鸡α干扰素对MDV和NDV有明显的抑制作用。

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV/MDV)的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(Bovineviraldiarrheavirus/mucosaldiseasevirus,BVDV/MDV)是引起牛病毒性腹泻/粘膜病的病原,与猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病病毒(BDV)同属.其基因组由5′非翻译区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3′非编码区(3′NCR)组成,编码结构蛋白P14、gP48、gP25、gP53及几种非结构蛋白.下面就BVD/MD的分子生物学研究进展做一综述,以便给该病的进一步防制奠定理论基础.

我国部分地区蛋鸡群ALV-J及与REV、MDV、CAV混合感染检测

为了解J亚群禽白血病病毒(ALV-J)及其与禽网状内皮细胞增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)和鸡传染性贫血病病毒(CAV)的混合感染现象,本研究从宁夏、湖北、广东、山东、辽宁、吉林、黑龙江7个省的39个蛋鸡群收集临床表现和剖检病理变化疑似禽白血病的病料样品184份,采用PCR、病毒分离和IFA检测样品中ALV-J、REV、MDV和CAV。结果表明,7个省蛋鸡场均存在ALV-J感染,病料样品阳性率为60.9%,检测鸡群阳性率为82.1%,与REV、MDV、CAV的混合感染率分别为13.6%、24.5%、22.8%,其中存在较为严重的双重感染(29.0%)和3重感染(18.8%),甚至4重感染(1.7%)。研究结果表明,我国蛋鸡群中普遍存在ALV-J感染,而且与REV、MDV、CAV混合感染严重;提示ALV-J已经可以引起蛋鸡群发病,在临床诊断和致病性研究中,应考虑到多重感染的影响。

我国自然发病鸡群中MDV、REV和CAV共感染的检测

从山东、河南、河北、北京、江苏、广东、广西、四川、吉林、辽宁、台湾11 省42 个不同鸡群收集临床有发病表现的828只病、死鸡的病理组织样品,用点杂交方法检测各个样品中马立克氏病病(Marek′s disease virus,MDV)、网状内皮细胞增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV) 、鸡传染性贫血病病毒(Chicken anemia virus,CAV)的感染情况。结果表明:828 只病鸡中这三种病毒的检出率均相当高,分别为83. 94% (MDV)、61. 0% (CAV)和57.25%(REV),并且存在非常严重的双重感染(31. 16%)和三重感染(44. 69%),单重感染和阴性个体仅占15.34%和8.82%;在42个鸡群中的29个存在三重感染,占鸡群总数的69.05%,5个鸡群存在MDV和CAV的共感染,3个鸡群存在MDV和REV的共感染,二重感染占鸡群总数的19.05%,仅有2个鸡群未检测到这三种病毒;在地域分布上,11个省份均检测到了MDV、CAV和REV,表明了这三种病毒在我国的广泛分布及其在生产鸡群中的混合感染是导致当前我国养禽业生产性能下降、条件致病性疾病发生严重、临床腺胃肿大症状发生的重要原因。

传染性法氏囊病病料中MDV、CAV、REV的共感染检测

从江苏、山东、浙江、河南、上海、广西、云南等地收集根据临床表现及病理变化诊断为传染性法氏囊病( IBD)的病鸡法氏囊样品 66份 ,用相应的核酸探针及斑点杂交法分别检测样品中鸡传染性贫血病病毒( CAV)、马立克氏病病毒 ( MDV)、网状内皮细胞增生病病毒 ( REV)的感染 ;用抗 IBD血清做琼扩检测 IB-DV。结果显示 ,部分地区病料中这些病毒有不同程度的二重感染、三重感染甚至四重感染。提示在研究特定毒株 IBDV的毒力时 ,应考虑多重感染对致病性的影响。

免疫鸡MDV感染后羽毛根HVT的分离及HVT免疫对MDV抗原检测的影响

５只ＨＶＴ免疫鸡，实验感染ＭＤＶ后的第１～１０周期间，分别采用初次细胞分离培养物上清中的自由病毒粒子鉴定，ｄｏｔ－ｂｌｏｔＤＮＡ杂交和常规ＡＧＰ试验等方法，对并发感染鸡羽毛根进行了病毒及病毒抗原的动态检测与比较。结果显示，在上述羽毛根中可同时存在ＨＶＴ粒子和ＭＤＶＤＮＡ。ＨＶＴ可分离时间为ＭＤＶ攻毒后１～７周；ＭＤＶＤＮＡ最早检出时间为ＭＤＶ攻毒后的第１８～２２天，并达到其持续性（２２～７０ｄ）的检出率最高峰（１００％）；而ＡＧＰ法对此期间鸡只羽毛根ＭＤＶ抗原的最早检出时间在第２２天，且检出率很低。因此，羽毛病毒抗原ＡＧＰ检测法，对免疫鸡只或鸡群ＭＤＶ感染的诊断仍然是特异的，但较单纯感染的检测，其检出率更低，因而更难以反映出免疫鸡群中ＭＤＶ感染的真实状况。

转化型人参皂苷抗MDV及诱导肿瘤细胞凋亡的作用初探

以转化型人参皂苷的8个组,按12.5μg·mL-1的剂量,在体外鸡胚成纤维细胞上进行抗MDV-RB1B强毒株空斑减数试验和诱导肝癌7402细胞株、大鼠脑胶质瘤细胞C6株细胞凋亡试验,用光学显微镜观察、琼脂糖凝胶电泳检测分析DNA损伤。结果表明:转化型人参皂苷6、7号组,在感染阻断、增殖抑制、直接杀灭3种方式的抗MDV空斑减数率都达到阿昔洛韦(ACV)抗MDV空斑减数率的80%,转化型人参皂苷4、6号组对MDV-RB1B株的直接杀灭作用与ACV的杀灭作用相同;转化型人参皂苷8号组诱导肝癌7402株细胞48h后,有60%的瘤细胞凋亡,对大鼠脑胶质瘤C6株细胞也有诱导凋亡的作用。

贵州土鸡中ALV-J、REV和MDV的混合感染

禽白血病、网状内皮组织增生症和马立克病是禽类最为常见的3种肿瘤病,可导致家禽出现严重的免疫抑制,继发感染其他疾病,对养禽业危害巨大。出现混合感染时,疾病的致病力和致肿瘤能力都远大于单一感染,导致的免疫抑制也更为严重。

用斑点杂交法同时检测鸡群中的CAV MDV和REV

为研究鸡传染性贫血病毒(CAV)在鸡群中的感染状况以及马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮细胞增生病病毒(REV)在鸡群中的发病率,用斑点杂交法对山东省4个肉鸡场和2个肉种鸡场进行CAV、MDV和REV的检测,结果表明除一个肉种鸡场没有检测出REV以外,其他鸡场均同时检测出CAV、MDV和REV,并且发现直接从病料中检测CAV的阳性率(20％)远远低于将病料接种SPF鸡胚后的检出率(80％)。

鸡MDV meq基因对鸡胚成纤维细胞p53基因表达的影响

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR的方法检测了鸡马立克氏病病毒(MDV)meq基因对鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)p53基因表达的影响,并用本室改进的TRAP法测定了端粒酶活性。结果显示,meq基因激活了CEF中原癌基因p53的表达,并且48 h的表达量是72 h的18.8倍;在对CEF和转染前后48、72 h的细胞端粒酶活性测定时也发现,端粒酶活性在转染后48 h是转染后72 h的16倍。流式细胞仪检测发现meq基因使S期细胞比例较转染前有所上升,进一步印证了meq基因是MDV中致瘤的主要因素。

共表达MDV糖蛋白B和鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建

Recombinant fowlpox viruses(rFPVs)coexpressing MDV gB and chicken type Ⅱ interferon (IFN-Ⅱ) gene were constructed by using different promoters of Ps and PE/L.rFPVs were selected and purified by blue plaque expressing β-galactosidase.The expression of MDV gB gene was confirmed by indirect immunofluorescence assay.The levels of MDV gB expressed in rFPV-gB-IFN under the control of the synthetic promoter Ps was same as that in rFPV-gB.The expression of IFN-Ⅱ was examined in chicken embryo fibroblast(CEF) by protection against vesicular stomatitis virus-induced cytopathic effect.The levels of IFN expressed in CEF was 640～1280 units/mL.When rFPVs were propagated in CEF,the plaque sizes of rFPV-gB were larger than those of rFPV-gB-IFN,the plaque formation units of rFPV-gB were also more than those of rFPV-gB-IFN.

MDV感染鸡羽毛根病毒抗原和DNA的动态检测

１０羽１４日龄鸡分别以马立克氏病毒（ＭＤＶ）ＢＪ－１株接毒，采集羽毛根作为ＭＤＶ琼扩抗原和ＭＤＶＤＮＡｄｏｔ－ｂｌｏｔ杂交的动态检测样品。接毒后第１０ｄ至第８周的检测结果显示，鸡羽毛根ＭＤＶ琼扩抗原及ＭＤＶＤＮＡ可分别在接毒后第１４ｄ（３７．５％，３／８）和第１２ｄ（３３．３％，３／９）检出；接毒后第１７ｄ至第５周，鸡羽毛根ＭＤＶ琼扩抗原的阳性检出率均大于８０％；第６，７和８周时，则分别降至６６．７％（４／６），５０％（３／６）和４０％（２／５）。而ＭＤＶＤＮＡ的检测，除１只鸡直到第４周才呈阳性外，其余在接毒后第１４ｄ至第８周中均保持１００％的阳性检出率。

雄激素受体拮抗剂MDV3100的合成研究

以3-三氟甲基-4-腈基-苯胺和二硫化碳为原料制备异硫氰酸酯4-异硫氰基-2-三氟甲基苯腈(2),以2-氟-4-硝基甲苯为原料,经氧化、酰胺化、催化氢化制得N-甲基-2-氟-4-氨基苯甲酰胺(5),5与2-溴异丁酸乙酯反应得到2-(3-氟-4-甲胺甲酰苯基)胺基苯胺-2-甲基丙酸乙酯(6),2和6在无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中缩合得到MDV3100(1),结构经MS和1H NMR确证,总收率18%(以2-氟-4-硝基苯甲酸计,n/n)。

MDV-1 VP22羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达

VP22是血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分。本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区。SDS-PAGE电泳发现,VP22C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右。将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22C端抗体。通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDVCEF所有细胞核中呈特异性表达。这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用。

硫酸化人参总皂苷对人工感染MDV鸡淋巴细胞活性的调节

鸡马立克氏病病毒(MDV)经腹腔注射感染8日龄雏鸡,攻毒15 d后检测硫酸化人参总皂苷对鸡外周血白细胞数和淋巴细胞增殖活性的影响,并利用半定量RT-PCR方法分析外周血淋巴细胞IFN-γmRNA的表达水平。结果表明,MDV感染能引起鸡淋巴细胞百分比相对增多(P<0.01),人参总皂苷及其硫酸化人参总皂苷不能改变MDV所致变化(P>0.05),且硫酸化人参总皂苷与人参总皂苷之间没有差异(P>0.05);MDV感染极显著抑制淋巴细胞增殖(P<0.01),人参总皂苷能明显改善MDV对感染鸡淋巴细胞增殖的抑制(P<0.01),硫酸化人参总皂苷促进了MDV所致的抑制状态(P<0.01);人参总皂苷及其硫酸化人参总皂苷均能增强MDV所致鸡淋巴细胞IFN-γmRNA的表达,与健康组相比,硫酸化人参总皂苷极显著增加IFN-γmRNA表达(P<0.01)。结果提示,硫酸化人参总皂苷对人工感染MDV鸡的淋巴细胞活性具有调节作用,其作用比人参总皂苷的作用更强。

MDV中meq基因对CEF细胞chTERT,chTR表达影响的研究

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR方法检测了MDV中meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT)、端粒酶RNA亚基(chTR)表达水平的影响,并用TRAP法测定了端粒酶活性,用流式细胞仪检测了细胞周期的变化.实验结果表明,转染48 h后chTERT表达水平为转染后72 h的16倍,chTR表达水平在转染前后基本不变;转染48 h后CEF细胞的相对端粒酶活性是转染72 h后的12倍;在转染后72 h S期细胞的百分比较未转染细胞显著增加.

MDV和AIV主要保护性抗原基因在鸡痘病毒中的联合表达

将强启动子Ps插入载体7S中构建成插入载体7SP,将鸡马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白B(gB)基因和禽流感病毒(AIV)血凝素H9A基因共同克隆到插入载体7SP中,获得重组转移质粒7SPGA,通过酶切鉴定获得Ps-gB与P7.5-HA同向的转移质粒,再将报告基因盒PL11-LacZ插入转移质粒7SPGA得7SPLGA,将质粒7SPLGA与禽痘病毒疫苗株共转染鸡成纤维细胞,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-Ps-gB-P7.5-HA,以间接免疫荧光法证实gB基因和HA基因同时得到表达。该研究为探索新型基因工程苗打下了良好的基础。

内蒙古白绒山羊小肠可吸收氨基酸模式对MDV和PDV组织游离氨基酸代谢影响的研究

选用3只体况良好,体重25～30kg的2周岁内蒙古白绒山羊半同胞羯羊,安装永久性十二指肠近端瘘管以及门静脉、肠系膜静脉、颈动脉、颈静脉慢性血插管进行试验。采用3×3拉丁方试验设计,3个试验处理的十二指肠氨基酸灌注模式分别为M、M90+C10、M80+C20。结果表明,小肠可吸收氨基酸模式对MDV和PDV组织SAA的净流量具有显著影响,其中Met随着绒毛模式所占比例的增加而显著提高(P<0105)。MDV组织Cys的净流量显著高于其小肠消失量。绒山羊胃肠道组织摄取了大量的BCAA。因此,在调整绒山羊小肠氨基酸模式时应注意BCAA,尤其是Leu的补充。小肠可吸收氨基酸模式对绒山羊体内氨基酸代谢的利用有显著影响,绒山羊小肠内理想的氨基酸模式应界于M90+C10和M80+C20之间。