重组人腺病毒表达的MDV-1 VP22蛋白的不同定位模式

目的:研究MDV-1 CVI988 VP22蛋白的转导机制及细胞定位机理,分析该蛋白在表达过程中细胞定位的影响因素。方法:构建表达VP22蛋白的重组人腺病毒,将重组病毒感染的AD-293细胞裂解产物加至正常的MDBK细胞上,通过免疫荧光(IFA)及Western blot鉴定VP22的蛋白转导功能。观察感染后不同时间VP22在AD-293细胞上的定位,并与瞬时表达的VP22蛋白定位比较。结果:重组人腺病毒表达的VP22在MDBK细胞上能够进入几乎所有的细胞,说明VP22蛋白具有很强的蛋白转导功能。进一步鉴定VP22的细胞定位发现,在重组病毒感染的AD-293细胞中,VP22首先聚集于细胞核周围,随后以特殊的荧光粒子的形式散在于胞质中,而AD-293细胞中瞬时表达的VP22及MDV感染的CEF中VP22均均匀分布于细胞核。结论:重组人腺病毒表达的VP22蛋白具有很强的蛋白转导功能,不同重组病毒表达的VP22在细胞中的定位模式有所差别。

MDV VP22的N1-18是发挥蛋白转导功能必需的序列

血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV-1)CVI988/Rispens弱毒株的VP22蛋白缺失201TKSERT206。为了进一步证实该缺失对MDV-1VP22蛋白转导功能和效率的影响,本研究通过将不同缺失型的VP22与EGFP相融合,转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光方法,检测VP22的蛋白转导现象。结果发现,EGFP-VP22具有微管结合、核膜结合、核酸结合、蛋白转导等特性;CVI988VP22与GA株VP22的转导效率相当,且只有完整长度的VP22具有明显的转导功能,其中,N端1～18aa对VP22的核定位及其蛋白转导功能的发挥意义很大。这一发现为利用MDV-1VP22携带其他目的蛋白转导,增强目的蛋白免疫原性及其治疗性功能具有重要的指导价值。

用马立克氏病病毒强毒的BamH-L片段核酸鉴定血清1型毒株

马立克氏病病毒 (MDV) GA强毒株的 Bam H - L 片段 DNA全长为 2 892 bp,G+C比率为 5 5 .91%。用内切酶将其亚克隆为 6个片段 :Bam H - Pst 、Pst - Pst 、Pst - Cla 、Cla - Sm a 、Sm a - Sma 和 Sm a - Bam H 。用地高辛标记 L 片段 DNA或者分别标记其 6个亚片段核酸 ,通过斑点杂交试验都可将 MDV血清 1型毒株与 2型和 3型的毒株区分开来 ,应用 PCR方法可获得相同结果。但 PCR方法更敏感、更快捷。结果表明 ,MDV GA强毒株的Bam H - L片段 DNA对 MDV血清

MSB-1培养物上清液对MDV的作用

研究了马立克氏病肿瘤细胞系（ＭＳＢ－１）培养物上清液对马立克氏病病毒（ＭＤＶ）体外增殖及体内致瘤作用的影响。结果表明，该上清液对体外ＭＤＶ的增殖有明显的特异性的抑制作用，并且这种抑制活性保持至少２３ｄ不降低，而对体内ＭＤＶ的致瘤作用有明显的促进作用，但其本身在鸡体内并无明显的快速致瘤作用。

免疫鸡羽毛根中火鸡疱疹病毒的分离与鉴定

用常规剂量的商用火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）冻干苗经腹腔免疫１日龄非免疫鸡，于第３周采集羽毛根，分别采取直接法和间接法（即经过滤获取脱细胞的游离物）接种次代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），以进行病毒的分离。结果显示，在免疫后第３、４、５、６周，２种方法都分离到病毒，第７周仅直接法分离到病毒，而第８周２种方法都没有分离到。根据分离到病毒的细胞病变（ＣＰＥ）特征，结合地高辛标记的Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ－１）核酸探针检测结果，表明ＨＶＴ免疫鸡羽毛根中含有可脱离细胞的、具有感染性的疫苗株ＨＶＴ粒子，且其可检出时间具有阶段性。

马立克氏病病毒Ⅰ型CVI988/Rispens疫苗株UL13激酶结构域分析及其偏嗜密码子片段在大肠杆菌中的表达

【目的】寻找MDV-1 UL13激酶催化中心,并体外表达UL13,以便研究UL13蛋白激酶的功能。【方法】用PCR方法从CVI988疫苗株基因组中扩增UL13基因,利用GENEART(www.gcua.de)分析UL13在大肠杆菌中表达时密码子的偏嗜性;通过DNAstar抗原性分析确定UL13的高抗原性片段,进行原核表达,并以切胶免疫方法免疫小鼠制备多抗血清;通过NCBI的protein blast功能及Cn3D 4.1在线软件分析UL13保守结构域。【结果】PCR扩增出UL13基因,序列分析结果表明,UL13的259～400aa、431～513aa两个片段抗原性强,且稀有密码子较少;保守结构域分析发现UL13催化中心主要位于152～297氨基酸残基间,且在激酶SubdomainⅦ的保守甘氨酸残基被丝氨酸替代,SubdomainⅧ的保守非极性脯氨酸残基被极性半胱氨酸残基替换。利用大肠杆菌表达的UL13第259～400aa片段免疫小鼠制备出多抗血清能与真核表达产物反应。【结论】MDV-1UL13催化中心主要位于152～297氨基酸残基间,体外表达的基因产物诱导机体产生了抗UL13激酶的特异性抗体。

马立克病毒基因缺失疫苗与商品化疫苗的分子鉴别方法

为了对马立克病毒(MDV)meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVT FC-126株进行分子鉴别,本研究根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对I型MDVmeq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列(REV-LTR)插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法区分SC9-1株与其他疫苗株。结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1 297bp、1 297bp目的片段,HVT FC-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT FC-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均没有条带。同时,使用针对meq基因的探针进行斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT FC-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均为阴性。因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法可有效区分SC9-1与其他商品化MD疫苗。

敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CVI988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较

【目的】比较敲除meq基因的马立克氏病毒(MDV)与标准疫苗株CVI988/Rispens对MDV超强毒GX0101攻毒的免疫保护作用。【方法】本实验将1日龄SPF鸡120只随机分成4组,每组30只,分别饲养在正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,第1组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种SC9-1;第2组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种CVI988/Rispens;第3、4组为不免疫攻毒对照组。免疫接种后5 d后,第1、2、3组分别以2000PFU/只的剂量腹腔接种MDV GX0101。饲养至90日龄,记录死亡情况,对死亡鸡只剖检,并取疑似马立克特有病变脏器做病理切片。期间,检测不同免疫状态下病毒GX0101的增殖动态以及禽流感、新城疫灭活苗在鸡体诱导产生抗体的水平。对含有MDV母源抗体的海蓝褐鸡的试验方案与SPF鸡一致。【结果】SC9-1株免疫对感染MDV GX0101攻击SPF鸡、海兰褐鸡均提供100%的免疫保护作用;CVI988/Rispens对SPF鸡、海兰褐鸡分别提供86.7%、93%的免疫保护作用。未免疫SPF鸡攻毒组死亡率为53.3%,肿瘤率为16.7%;未免疫海兰褐鸡攻毒组死亡率为36.7%,肿瘤率为6.67%;相比,空白对照组鸡只没有任何病变及死亡。荧光定量结果显示,淋巴细胞和羽毛囊DNA中,SC9-1免疫组鸡体内GX0101的病毒拷贝数显著低于CVI988/Rispens免疫组。血凝抑制试验结果显示,SC9-1免疫攻毒组鸡的产生的AIV、NDV抗体水平高于CVI988/Rispens免疫攻毒组。【结论】SC9-1株免疫无论在SPF鸡还是含有MDV母源抗体的海兰褐鸡均能提供比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。