MDV-gB重组痘苗病毒诱导的免疫保护性试验

用MDV gB重组痘苗病毒RVV gB,HVT冻干苗、痘苗病毒WR株分别按试验程序,对细胞免疫及体液免疫检测试验中的1日龄SPF鸡进行免疫接种,并于15日龄对各组小鸡攻GA株强毒,后经过IFA检测抗体,以及以PHA为有丝分裂原检测淋巴C转化.结果表明,重组病毒和HVT冻干苗均获得较高保护,体液免疫差异不显著;细胞免疫在攻毒前差异不显著,但攻毒后第2d开始,RVV gB组淋巴细胞转化率明显高于HVT冻干苗.

MDV-gB重组痘苗病毒诱导免疫的检测及保护性

用MDV gB重组痘苗病毒RVV gB、HVT冻干疫苗、痘苗病毒WR株分别按试验程序对细胞免疫及体液免疫检测试验中的 1日龄SPF鸡进行免疫接种 ,并于 15日龄时对试验各组鸡用GA株强毒攻击 ,经IFA抗体检测 ,及以PHA为有丝分裂原的淋巴细胞转化检测 ,结果表明 ,重组病毒和HVT冻干疫苗免疫鸡均获得了较高保护 ,体液免疫效果差异不显著 ;细胞免疫效果在攻毒前差异不显著 ,但攻毒后第 2d开始 ,RVV gB免疫组鸡的淋巴细胞转化率明显高于HVT冻干疫苗免疫组鸡。

SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究

目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并获得SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD并通过各项试验证明其安全性和免疫原性。

人癌胚抗原-重组痘苗病毒的构建和制备

痘苗病毒的基因组庞大，结构复杂而特殊，不可能将外源基因直接插入它的基因组，必须利用一种特殊的痘苗病毒质粒，才能构建成功重组痘苗病毒．在分析了痘苗病毒质粒ｐＪ１２０〔含有我国天花疫苗－痘苗病毒天坛株７６１的启动子和胸苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ，简称ＴＫ基因），及含有人癌胚抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ，简称ＣＥＡ）ｃＤＮＡ全序列的质粒ｐ９１０２３Ｂ－ｃｅａ－１７结构的基础上，设计出三步法构建了重组疫苗病毒质粒ｐＪ－ＣＥＡ．经酶切及ＰＣＲ鉴定ｐＪ－ＣＥＡ中ＣＥＡｃＤ－ＮＡ的存在，进一步用同源重组方法构建了表达人ＣＥＡ的重组痘苗病毒，并以人体成纤维细胞作为宿主细胞，对ＣＥＡ－重组痘苗病毒进行了大量培养．再次证实痘苗病毒是良好的真核表达载体，可以高效而准确地表达细胞膜糖蛋白ＣＥＡ．

呼吸道合胞病毒糖蛋白F和G在同一个重组痘苗病毒中的表达

在使用痘苗病毒启动子P11k、P25k和P7.5k研究呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白F和G表达效率的基础上,构建成功同时表达BSV F和G糖蛋白的重组痘苗病毒(VMS11G75F)。结果表明,11k和7.5k启动子可以象单独表达RSV F或G一样有效地同时表达RSVF和G。荧光检测显示,RSV F和G主要分布于细胞膜表面,部分RSVF分布于胞浆近核膜处。这种荧光分布特征在RSV F和G单独表达和同时表达的重组痘苗病毒中无明显差别。Westernblot表明,痘苗病毒表达的RSV糖蛋白G具有一条分子量约为90kD的弥散带,与RSV感染细胞产生的RSV G相同;RSVF除具有与RSV感染细胞产生的F1(48kD)和F2(20kD)相同的两种形式外,尚有少量未被蛋白酶水解的F0(6skD)。RSVF和G同时表达的重组痘苗病毒VMS11G75F经传15代后,在表达水平和基因组水平上都具有良好的遗传稳定性。

CEA-重组痘苗病毒预防CEA阳性肿瘤的动物实验研究

目的：探讨 Ｃ Ｅ Ａ重组痘苗病毒对 Ｃ Ｅ Ａ 阳性肿瘤的预防作用。方法：构建 Ｃ Ｅ Ａ 阳性小鼠 Ｈｅｐａ 肝癌细胞模型（ Ｈｅｐａ Ｃ Ｅ Ａ＋ ） 。将实验鼠分为４ 组，先分别皮下接种痘苗病毒（ 野生型 Ｗ Ｖ Ｖ 或重组型 Ｃ Ｅ Ａｒ Ｖ）３ 次，再分别颈背部皮下注射 Ｃ Ｅ Ａ 阳性或 Ｃ Ｅ Ａ 阴性同源鼠 Ｈｅｐａ 肝癌细胞。观察动物反应并在接种癌细胞后每周测量一次肿瘤大小。结果：３ 个对照组各鼠颈背部皮下均可见有瘤块形成，并且以相近速率快速增长，３ 组之间无统计学上的显著差异，而接种 Ｃ Ｅ Ａｒ Ｖ／ Ｈｅｐａ Ｃ Ｅ Ａ＋ 组各鼠在观察期限内均无肿瘤形成。整个实验过程中实验鼠未表现有毒副反应。结论： Ｃ Ｅ Ａｒ Ｖ 通过诱导机体的免疫系统产生 Ｃ Ｅ Ａ 特异性的细胞和体液免疫应答反应，能有效预防小鼠移植性 Ｃ Ｅ Ａ 阳性肿瘤的形成。

表达HIV多价抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫效果研究

为了构建适用于中国的HIV候选疫苗,利用痘苗病毒天坛株表达中国HIV 1主要流行毒株CN54的gagpolΔ和gp140TM基因。实验结果显示,重组痘苗病毒能正确表达Gag和gp140TM蛋白。获得的重组痘苗病毒与DNA疫苗、重组腺病毒联合免疫Balb/c小鼠,并检测不同免疫程序在小鼠中诱导的细胞和体液免疫。免疫实验表明,DNA疫苗初始免疫,重组腺病毒与重组痘苗病毒依次加强所诱导的CTL应答、T淋巴细胞增殖以及中和抗体均高于其他免疫方案。DNA疫苗与两种活载体疫苗的联合运用,在小动物模型中取得了较好的免疫效果,这将为艾滋病疫苗的研究增加新的免疫策略。

用重组痘苗病毒作载体表达甲型肝炎病毒抗原

含有甲型肝炎病毒基因组全部开放读码框架cDNA的重组痘苗病毒,感染143TK^-细胞后,成功地表达了甲肝病毒抗原。ELISA测定其滴度为1:8。免疫荧光法显示,荧光呈颗粒状分布在胞浆内。Western blot证实,重组痘苗病毒表达的甲肝病毒抗原有两条特异性带,一条分子量为29kd,与甲肝病毒抗原VP2相对应;另一条分子量为64kd,可能是未全裂解的甲肝病毒抗原蛋白或聚合体。初步动物免疫实验表明,痘苗病毒表达的甲肝病毒抗原具有较好的免疫原性。

乙型脑炎重组痘苗病毒的抗原表达及其免疫保护性

采用乙型脑炎重组痘苗病毒Ｊ１和Ｊ３株，两者均含乙脑病毒（ＪＥＶ）的Ｅ、ＮＳ１和ＮＳ２Ａ基因，后者还含ＰｒＭ基因，在ＢＨＫ－２１－１５细胞中培养表达，经免疫荧光法（ＩＦＡ）测定，两者均可高效表达ＪＥＶ特异性抗原。用该重组病毒免疫瑞士种小鼠，经ＩＦＡ检测证明Ｊ１、Ｊ３均可诱生抗ＪＥＶ抗体，其中Ｊ３免疫鼠还产生中和抗体（Ｎ）和血抑抗体（ＨＩ），且其抗ＪＥＶ攻击能力显著增高。

甲型肝炎重组痘苗病毒(VMS11HAV25)的构建及其某些生物学性质

将5′端经过剪切的甲型肝炎病毒全部开放读码框架cDNA连接于痘苗病毒晚期启动子P11下游,重组于痘苗病毒天坛株的HiodⅢM片段Spb Ⅰ位点获得了重组病毒VMS11HAV25。对其生物学性质的研究表明,该重组病毒诱生痘苗抗体的能力、对鸡红细胞的血凝性质、空斑大小及对温度的稳定性等均与原天坛株相同。重要的区别是,重组病毒在家兔皮内和小鼠脑内的毒力都比原天坛株低约1个对数。病毒在人胚肺二倍体细胞连续传15代的表达水平与传代早期者相同。连续传20代后提取病毒DNA做Southern blot杂交表明,甲型肝炎病毒基因仍稳定地存在于原插入位置。

表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒的组建与鉴定

把狂犬病毒标准攻击株(Standard challenge virus)的糖蛋白编码序列插入天坛株痘苗病毒的胸腺核苷激酶(TK)基因区,并置于痘苗病毒7.5k蛋白启动子(P7.5)的控制之下,构建了两株重组痘苗病毒。它们在起始密码子上游一侧的核苷酸序列稍有差别,但均能有效地表达狂犬病毒的成熟糖蛋白并能转运至细胞膜上。免疫学试验及动物试验结果表明,重组痘苗病毒表达的狂犬病毒非融合性糖蛋白分子量约为64kD;均能与狂犬病毒天然糖蛋白单克隆抗体发生特异性反应,并能在小鼠和家兔中诱生高滴度狂犬病毒中和抗体(VNA)并对致死量狂犬病毒攻击动物具有保护能力。

IL-5在非复制重组痘苗病毒中的表达及其对重组病毒免疫效果的影响

利用非复制型痘苗病毒表达载体 pNEOCK11β75IL5和重组病毒RVJ12 3,通过两步重组构建了能同时表达IL 5和乙型肝炎病毒HBsAg的非复制型重组痘苗病毒RVJ12 3Δ11β75IL5。Southern blot证实 ,痘苗病毒C K片段间基因缺失的同时伴有IL 5基因的插入。鼻腔吸入分别免疫Balb/c小鼠和新西兰白兔 ,ELISPOT实验证实 ,免疫后两周小鼠肺淋巴细胞的抗HBsAgIgA抗体分泌细胞 (ASC)数比对照组 (RVJ12 3Δ11β75 )增加约 2倍 ,而同时小鼠肺淋巴细胞的抗HBsAgIgG抗体分泌细胞 (ASC)数与对照组无差别。可在小鼠血液、肺浸出液以及新西兰白兔血液、肺浸出液、其它分泌液样品中检测到抗乙型肝炎病毒HBsAg的特异性的IgA、IgG抗体 ,与对照组相比 ,IgA抗体阳转率及抗体滴度提高 ,而IgG则无差异。本实验说明 :IL 5可在体内选择性地增强机体的粘膜IgA反应。提示非复制载体疫苗中 ,表达的该细胞因子可有效的增强疫苗的粘膜免疫反应 。

同时表达麻疹病毒L4株HA和F蛋白及人白细胞介素2(IL2)的重组痘苗病毒疫苗株的构建

构建了同时表达麻疹病毒ＬＡ株ＨＡ和Ｆ基因及人白细胞介素２（ＩＬ２）的重组痘苗病毒疫苗株ＲＶＪＭＬＨＡＦＫＩＬ２。Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ结果显示，ＨＡ、Ｆ和人ＩＬ２基因均在痘苗病毒中稳定有效表达，且产物与天然蛋白相近。ＨＡ分子有糖化的７９ｋＤ和非糖化的田ｋＤ两种形式；Ｆ分子以６０ｋＤ的前体Ｆ０、４３ｋＤ的Ｆ１和１８ｋＤ的Ｆ２三种形式存在。表达产物的血凝效价为１：８，血溶活性ＯＤ５４０的测定结果是Ｏ３７。该重组病毒免疫新西兰白兔及Ｃ５７小鼠，可以产生抗麻诊病毒ＨＡ和Ｆ蛋白的特异性ＥＬＩＳＡ（１：６４４～１６００）、血凝抑制（１：２５６～５１２）、血溶抑制（１：８０～１６０）和ＮＴ（１：６４０）抗体。接种兔及裸鼠后的毒力反应，明显低于只表达ＩＬ２的重组痘苗病毒疫苗株ＲＶＪ１２３，表现为兔皮肤红肿范围小，持续时间短，皮肤无坏死；裸鼠毒力的结果，表现出ＲＶＪＭＬＨＡＦＫＩＬ２病毒只存留于接种局部，而且滴度大大降低，未发现该病毒向其它脏器播散和增殖。麻疹重组痘苗病毒疫苗株的构建为该疫苗株的人体免疫观察奠定了基础。

表达EB病毒主要膜蛋白gp350/220的非复制型重组痘苗病毒的构建

利用非复制痘苗病毒质粒载体 pNEOCK11β75及 pNEOCK ,改造了表达EB病毒主要膜蛋白 gp35 0 /2 2 0的复制型重组痘苗病毒VMA ,构建了非复制型重组痘苗病毒VMAΔCK。该病毒能在鸡胚原代成纤维细胞 (CEF)中正常繁殖 ,而在人源细胞中不能正常繁殖。在CEF中连续传代至第 2 5代 ,经PCR证明 ,该病毒符合非复制型重组痘苗病毒的特征。经免疫荧光及免疫酶斑法证实 ,VMAΔCK可稳定表达gp35 0 /2 2 0 ,且表达水平与VMA无明显差异。VMAΔCK经腹腔免疫Balb/C小鼠 ,4周后能诱生一定水平的抗 gp35 0 /2 2 0特异性抗体 ,加强免疫 2周后该抗体水平明显升高。这一结果类似于VMA免疫Balb/C小鼠的结果。初免后 ,VMAΔCK免疫组抗痘苗抗体水平明显低于VMA免疫组 ;加强免疫 2周后 ,两组小鼠的抗痘苗抗体水平趋于一致。上述结果证明 ,所构建的非复制痘苗病毒不影响目的抗原的表达 ,也不影响该抗原的免疫原性 ,但导致病毒毒力下降 ,而且用该病毒免疫小鼠后小鼠抗痘苗病毒载体的免疫反应明显下降。

CEA重组痘苗病毒免疫治疗CEA阳性肿瘤机制的研究

目的 :探讨癌胚抗原重组痘苗病毒 (rV CEA)治疗癌胚抗原 (CEA)阳性肿瘤的机制。方法 :使用我室构建的rV CEA腹腔接种供体C5 7 BL小鼠后取其脾细胞过继转移给经6 0 Coγ射线亚致死量照射的荷CEA+ HePa肝癌细胞的C5 7 BL小鼠 ,并同时检测该供体小鼠脾细胞体外杀瘤细胞效应。结果 :接种了rV CEA的供体小鼠的脾细胞过继免疫给受体 ,具有明显抑制CEA阳性肿瘤细胞生长的作用。结论 :本研究提示rV CEA对CEA阳性肿瘤的抑制作用可能主要是通过CEA特异的免疫反应激活T细胞而实现的 ,其机制值得进一步研究。

不同启动子对重组痘苗病毒表达狂犬病病毒糖蛋白基因的影响

以血凝素（ＨＡ）基因为侧翼，将狂犬病病毒糖蛋白基因ｃＤＮＡ置于不同类型的痘苗病毒复合启动子下游，构建了４种表达质粒。重组表达质粒转染已感染ＷＲ株痘苗病毒的ＢＨＫ２１细胞，并通过鸡红细胞吸附试验，筛选、纯化出与表达质粒对应的４组ＨＡ－重组痘苗病毒：ｖＳＦＪ１－１０ＲＶｇｐ，ｖＳＦＪ２－１６ＲＶｇｐ，ｖＲＪ１－１０ＲＶｇｐ，ｖＲＪ２－１０ＲＶｇｐ。经间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）鉴定，从４组重组病毒中每组各鉴定出１株阳性重组病毒。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示，重组病毒感染的ＢＨＫ２１细胞裂解物上清中有１种蛋白与抗ＲＶＧＰ的ＭｃＡｂ发生特异反应，分子量为６９０００。在重组病毒感染早期，ＲＶＧＰ的表达量以ｖＳＦＪ１－１０ＲＶｇｐ最高；而在感染晚期，则以ｖＳＦＪ２－１６ＲＶｇｐ最高。４株重组病毒免疫小鼠，均能够不同程度地诱导小鼠产生抗ＲＶＧＰ特异性抗体。

恶性疟原虫保护性抗原复合基因-痘苗病毒重组活疫苗株的构建

将本实验室合成的一段编码恶性疟原虫不同发育阶段抗原表位基因，包括裂殖子表面抗原ＭＳＡ１、ＭＳＡ２、环子孢子蛋白ＣＳＰ及环状体感染红细胞表面蛋白ＲＥＳＡ以及来自白细胞介素－１（ＩＬ－１）和破伤风类毒素（ＴＴ）上Ｔ细胞激活位点等的复合抗原基因（ＨＧＦＳＰ），先定向克隆人ｐＳＫ载体的ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点，后用ＥｃｏＲＩ单酶切、补平及用ＳａｃⅠ单酶切下的目的基因再定向克隆人痘苗病毒表达载体ＰＪ２－１６的ＳｍａⅠ、ＳａｃⅠ位点，转化ＴＧ－Ⅰ宿主菌，重组子经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶分析及酶谱等鉴定，证实并筛选出了目的基因已插入到ＰＪ２－１６血凝素（ＨＡ）基因内的重组子，构建了恶性疟原虫抗原基因－痘苗病毒表达载体。将该重组表达载体与痘苗病毒天坛株经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ处理，在Ｃｏｓ－７细胞内进行共转染和同源重组，转染物接种ＢＨＫ２１细胞，经鸡红细胞吸附试验挑选不吸附鸡红细胞的病毒斑（ＨＡ－），共筛选出两株ＨＡ－重组病毒，用抗该目的基因大肠杆菌表达蛋白抗体对重组病毒表达产物进行间接免疫荧光、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等试验证明，两株重组病毒中有一株可表达目的蛋白，蛋白分子量与按目的基因长度?

HIV－1gag基因重组痘苗病毒的构建和高效表达

Ｇａｇ蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）重要的结构蛋白，可诱导机体产生体液和细胞免疫应答。本试验将ＨＩＶ－１不同长度的长末端重复序列（ＬＴＲ）和全长的ｇａｇＯＲＦ置于痘病毒启动子控制下，经过同源重组、红细胞吸附试验筛选和间接免疫荧光试验鉴定，分离了６株重组痘苗病毒。免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫酶试验检测表明，６株病毒均能表达ｇａｇ基因，其中以ｖ１６ＬＧ△２的Ｇａｇ蛋白表达量最高，占细胞裂解物上清的５．１９％，相当于１４．７μｇ／１０６细胞，接近杆状病毒的表达产量。重组蛋白主要为ｐ５５ｇａｇ蛋白前体，但也有一部分被加工，生成成熟蛋白ｐ２４ｇａｇ、ｐ１７ｇａｇ及其中间蛋白。表达的重组蛋白可形成病毒样粒子（ＶＬＰ）。

癌胚抗原重组痘苗病毒转染树突状细胞诱导CEA特异性T细胞免疫

目的 研究人癌胚抗原重组痘苗病毒 (rV CEA)转染树突状细胞 (DC)在体外诱导CEA特异性的T细胞免疫。方法 将rV CEA转染外周血单个核细胞来源的DC后用于激发自体的T细胞 ,通过对T细胞的增殖及杀伤功能的检测 ,与野生型痘苗病毒 (V 76 1)转染的DC激发的T细胞进行比较。结果 经rV CEA转染的DC激活的T细胞增殖力强 ,对CEA分泌性肿瘤细胞具特异性杀伤作用。结论 rV CEA转染的DC可以诱导CEA特异性T细胞活性。

表达甲型肝炎病毒抗原的重组痘苗病毒(VMS11 HAV25)的免疫原性

甲型肝炎(甲肝)病毒基因全部开放读码框架cDNA重组于痘苗病毒天坛株DNA的HindⅢM片段,获得了重组痘苗病毒VMS11HAV25。用10~7PFU或10~8PFU病毒量皮内免疫家兔,能诱生甲肝病毒抗体,其滴度与免疫剂量、免疫次数及间隔有关。组织培养中和试验表明,该抗体具有中和甲肝病毒的能力。VMS11HAV25的免疫效果似优于本实验室已报道的另一株甲肝病毒基因重组于TK区的重组痘苗病毒Re41。