人MEPE/OF45基因的克隆及序列分析

目的:克隆人MEPE/OF45全长基因,为进一步研究MEPE/OF45在DNA损伤应答中的作用及特异的信号通路奠定基础。方法:选取人宫颈癌细胞HeLa为靶细胞,从中提取总RNA,设计扩增人MEPE/OF45基因片段的特异引物,进行RT-PCR分析;用蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮(CHX)对细胞进行处理,观察处理前后MEPE/OF45基因的表达情况。结果:在经CHX处理的HeLa细胞中扩增到了MEPE/OF45基因片段,随后利用重叠PCR方法获得了人MEPE/OF45全长基因,并经序列分析确证。结论:获得了人MEPE/OF45基因片段及全长基因,为阐明MEPE/OF45在细胞中复杂的功能提供了线索。

太行鸡与隐性白羽鸡杂交后代羽色及SLC45A2和TYR基因变异分析

为探究太行鸡与隐性白羽鸡杂交后代羽色及其与SLC45A2和TYR基因变异位点的相关性,本试验对太行鸡与隐性白羽鸡进行正反交,F_1代(山水羽、麻羽)横交固定产生F_2代,统计分析2个世代个体的羽色表型并利用PCR和DNA测序筛选SLC45A2基因变异位点,将经分子鉴定的16只银羽杂合子隐性白羽公鸡与金羽半合子太行母鸡进一步杂交验证,同时利用分子检测方法鉴定TYR基因隐性白羽变异位点基因型。结果显示,F_1代出现山水羽、麻羽和白羽,其中正交F_1代山水羽、麻羽个体比例分别为79.0%和15.7%,反交F_1代山水羽、麻羽个体比例分别为15.8%和77.3%,正、反交F_1代白羽个体比例分别为5.2%和6.8%。F2代有色羽(山水羽、麻羽、深麻羽、芦花羽)与白羽鸡分离比符合孟德尔分离定律。杂交后代山水羽鸡SLC45A2基因第4外显子存在银羽突变位点c.1039C>A,麻羽鸡中未发现此变异。杂交验证后代山水羽鸡与麻羽鸡的比例接近为1:1,实际结果与理论结果相一致。杂交后代白羽鸡TYR基因内含子4的7.7 kb病毒插入突变分子检测基因型均为cc,有色羽鸡基因型为CC/Cc。结果表明太行鸡与隐性白羽鸡杂交后代羽色出现明显分化,反交组麻羽占比率相对正交组更高,银羽显性表现导致山水羽表型;白羽为常染色体隐性遗传。研究结果为太行鸡肉用特定羽色的选育与不同羽色品系培育提供了科学理论依据。

p53基因突变对胶质母细胞瘤细胞Connexin45蛋白表达影响

目的探究p53基因突变对胶质母细胞瘤细胞连接蛋白45(Connexin45)表达的影响。方法培养胶质母细胞瘤细胞U87细胞(p53野生型)和U251细胞(p53突变型),使用免疫印迹法检测两种细胞P53和Con-nexin45蛋白的表达。结果与U87细胞相比,U251细胞中P53蛋白和Connexin45蛋白的表达均明显降低,差异均有统计学意义(t=6.054、4.199,P<0.05)。结论p53突变可能会引起胶质母细胞瘤细胞Connexin45蛋白的表达降低。

基于TCGA数据分析TRIM45基因在乳腺癌中的表达特征及生物学功能

目的基于GDC TCGA Breast Cancer(BRCA)的数据,评估TRIM45(Tripartite Motif Family 45)在乳腺癌中的表达、预后价值及其与临床病理的相关性,揭示TRIM45在乳腺癌中的生物学功能及可能的作用机制。方法采用R软件对GDC TCGA Breast Cancer(BRCA)数据进行生信分析,研究TRIM45在乳腺癌中的表达及其与临床病理的关系。采用Kaplan-Meier法评估TRIM45对乳腺癌预后的影响。应用KEGG基因集进行GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)基因富集分析,采用Spearman相关性分析筛选TRIM45相关作用基因。结果TRIM45在乳腺癌临床样本中的表达高于癌旁组织(P<0.001);Kaplan-Meier生存分析显示TRIM45高表达患者的总生存期高于TRIM45低表达者(P<0.05);TRIM45在乳腺癌中的表达与T分期、TNM分期、分子分型及病理类型相关联(P<0.05);GSEA富集分析结果显示TRIM45在KEGG_PATHWAYS_IN_CANCER信号通路中发挥重要的生物学作用,Spearman相关性分析筛选出TRIM45与STK36、IKBKB、GLI3具有正相关关系(P<0.001),与HIF1A具有负相关关系(P<0.001)。结论TRIM45在乳腺癌中的表达与T分期、TNM分期、分子分型及病理类型相关联;TRIM45可能通过调控STK36、IKBKB、GLI3和HIF1A在乳腺癌发生发展中发挥重要作用。

RNA结合蛋白RBM45在肝癌中的表达及其临床意义

目的探讨核糖核酸结合基序蛋白45(RNA-binding motif protein 45,RBM45)在肝癌中的表达及其临床应用价值。方法应用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析RNA结合蛋白RBM45在肝癌中的表达,并关联临床资料及病理特征进行统计学分析。运用基因富集分析软件GSEA对肝癌组织中与RBM45相关的基因进行KEGG信号通路富集分析。结果与癌旁组织相比,肝癌组织中RBM45表达明显升高(P<0.001),且RBM45表达水平与患者临床分期、肿瘤分级及预后均显著相关(P<0.05),通过构建单变量和多变量COX风险回归模型分析RBM45表达与临床资料的相关性,结果表明RBM45可做为肝癌患者独立预后的危险因素(HR:2.75695%CI:1.785-4.255,P=4.813e-06);KEGG富集分析显示,RBM45可能与细胞周期、卵母细胞减数分裂、泛素介导的蛋白水解等信号通路密切相关。结论RBM45在肝癌组织中高表达,且其高表达的患者预后较差;RBM45表达可作为肝癌患者预后判断的独立标志物。

4例罕见基因位点突变的新生儿先天性肌病临床表现及基因表型

目的分析4例罕见基因位点突变的新生儿先天性肌病(CM)临床表现及基因表型。方法回顾性分析4例CM患儿的临床资料及基因检测结果,通过分析临床资料总结其临床表现,通过分析基因检测结果分析其突变基因表型。结果4例CM患儿均为新生儿期发病,伴有不同程度的肌张力减低,肌酸激酶轻度升高,预后差。基因测序显示,COL12A1基因c.7622(exon49)C>T,p.S2541F的错义突变,NEB基因c.25288C>T(p.Arg8430)的无义突变及c.2783delC(p.Pro928fs)移码突变,FLNC基因c.4021(exon23)C>T(p.R1341X,1385)的错义突变,UNC45B基因c.2591(exon20)A>C(p.H864P),c.2357(exon18)T>A(p.M786K)的错义突变,均为罕见变异及致病基因,其中3个错义突变、1个无义突变合并移码突变。结论罕见基因位点突变致新生儿CM临床表现均有异质性,表现为肌张力及肌力的严重降低,并伴有不同程度的并发症,临床症状不典型;分别发现FLNC基因、UNC45B基因、NEB基因、COL12A1基因4个罕见新发位点突变,其中3个错义突变、1个无义突变合并移码突变。

AtWRKY45调控拟南芥耐盐性的机制初探

拟南芥AtWRKY45基因参与离子吸收及叶片衰老过程,而在响应盐胁迫中的作用尚不清楚。为研究AtWRKY45是否参与盐胁迫过程,检测盐胁迫下At WRKY45基因的表达,结果显示AtWRKY45受盐胁迫诱导表达。基于此,以拟南芥AtWRKY45突变体和过表达植株为研究对象,观察其在盐胁迫条件下的表型及检测相关基因表达。结果显示突变体植株相较野生型而言电导率更低、叶绿素含量相对值更高,说明突变体株系对盐胁迫更不敏感,而过表达株系趋势则相反,说明过表达株系对盐胁迫更加敏感。此外,NaCl处理使得胁迫相关基因(AtRD29A、AtCOR15A)在突变体植株中均被上调表达,在过表达植株中被下调表达,烟草瞬时表达实验显示表达AtWRKY45相较对照而言AtCOR15A的荧光强度显著下降,说明AtWRKY45能显著抑制AtCOR15A的转录激活活性。以上结果表明AtWRKY45负调控拟南芥对盐胁迫的抗性。研究初步解析了AtWRKY45调控植物耐盐性的功能,为分子育种解决作物对盐胁迫敏感问题提供候选基因。

GADD45β在骨关节炎中的作用及其对MKK7/JNK途径的影响

目的探讨生长抑制和DNA损伤诱导基因45β(GADD45β)在骨关节炎(OA)发生发展中的作用及机制。方法将大鼠软骨细胞分为对照组、IL-1β组、NC-OE+IL-1β组、GADD45βOE+IL-1β组、NC-sh+IL-1β组和GADD45βsh+IL-1β组。除对照组之外,其他组细胞均采用10 ng/mL的IL-1β处理24 h。采用MTT法和TUNEL法检测软骨细胞增殖和凋亡。将SD大鼠分为假手术组、OA组、NC-OE+OA组和GADD45βOE+OA组,每组12只。假手术组大鼠只进行假手术操作,其他组大鼠均为前交叉韧带切断加内侧半月板部分切除法诱导的OA模型大鼠。假手术组和OA组大鼠关节腔内注射磷酸盐缓冲液,NC-OE+OA组和GADD45βOE+OA组大鼠关节腔内分别注射NC-OE和GADD45βOE慢病毒,每周注射1次,共4周。采用番红O-固绿染色观察大鼠软骨降解并进行OARSI评分,采用TUNEL染色检测大鼠软骨细胞凋亡。采用RT-qPCR检测GADD45β、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP13、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平。采用Western blot检测GADD45β、丝裂原活化蛋白激酶激酶7(MKK7)、p-MKK-7、c-Jun氨基末端激酶(JNK)1/2/3和p-JNK1/2/3的蛋白水平。结果与对照组比较,IL-1β组软骨细胞的GADD45βmRNA和蛋白水平降低,相对细胞活力和Bcl-2 mRNA水平均降低,TUNEL阳性率以及Bax、MMP3、MMP13、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平均升高,MKK-7和JNK1/2/3的相对磷酸化水平升高(P<0.05)。与IL-1β组和NC-OE+IL-1β组比较,GADD45βOE+IL-1β组软骨细胞的GADD45βmRNA和蛋白水平升高,相对细胞活力和Bcl-2 mRNA水平均升高,TUNEL阳性率以及Bax、MMP3和MMP13、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平均降低,MKK-7和JNK1/2/3的相对磷酸化水平降低(P<0.05)。与IL-1β组和NC-sh+IL-1β组比较,GADD45βsh+IL-1β组软骨细胞的GADD45βmRNA和蛋白水平降低,相对细胞活力和Bcl-2 mRNA水平均降低,TUNEL阳性率以及Bax、MMP3、MMP13、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平均升高,MKK-7和JNK1/2/3的相对磷酸化水平升高(P<0.05)。与假手术组比较,OA组大鼠的GADD45β的mRNA和蛋白水平降低,Bcl-2 mRNA水平降低,OARSI评分和TUNEL阳性率均升高,Bax、MMP3、MMP13、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平均升高,MKK-7和JNK1/2/3的相对磷酸化水平升高(P<0.05)。与OA组和NC-OE+OA组比较,GADD45βOE+OA组大鼠的GADD45β的mRNA和蛋白水平升高,Bcl-2 mRNA水平升高,OARSI评分和TUNEL阳性率均降低,Bax、MMP3、MMP13、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平均降低,MKK-7和JNK1/2/3的相对磷酸化水平降低(P<0.05)。结论GADD45β在OA中下调,上调GADD45β可能通过抑制MKK7/JNK途径抑制OA进展。

Smac基因过表达对胃癌细胞株MKN-45化疗敏感性的影响

背景与目的:细胞凋亡异常是肿瘤细胞产生耐药性的关键因素之一。Smac(secondmitochondria-derivedactivatorofcaspases,Smac或称DIABLO)是新近发现的一种凋亡调节基因,在介导化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡中起重要作用。本研究旨在观察Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性的影响。方法:采用脂质体GeneSHUTTLE-40介导的方法,将Smac基因转入胃癌细胞MKN-45,RT-PCR和Westernblot法检测癌细胞中Smac的表达;选用顺铂(1、5、10μg/ml)、丝裂霉素(0.1、1、10μg/ml)和姜黄素(10、20、40μmol/L)分别处理转染前后的胃癌细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性,倒置显微镜下观察细胞形态变化并摄影,AnnexinV-FITC和碘化丙啶双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:同未转染对照组比较,转染外源性Smac基因后MKN-45细胞SmacmRNA和蛋白表达水平显著增高(P<0.01);各浓度顺铂、丝裂霉素和姜黄素处理24h后,细胞生长抑制率分别增加10.10%～23.80%(P<0.01)、10.01%～15.86%(P<0.01)、11.28%～22.12%(P<0.01),细胞明显变圆、折光增强、漂浮细胞增多,细胞凋亡率分别增加6.7%～20.2%(P<0.01)、5.4%～13.2%(P<0.01)、10.6%～20.1%(P<0.01)。结论:转染外源性Smac基因并使其在胃癌细胞中过表达。

小麦抗叶锈病基因Lr45的SSR分子标记

用定位于2A染色体的59对SSR、EST-SSR引物,对小麦抗叶锈病基因Lr45进行分子标记,共筛选出11对揭示TcLr45多态性的引物。用157株F2抗感群体对这11对引物进一步检测,得到4个与Lr45共分离的SSR标记(Xgwm95、Xgwm47、Xgwm372和Xgwm122)。将经PAGE检测的标记Xgwm95的抗感差异带及Xgwm47的抗性片段进行克隆测序发现其中含有微卫星序列,且均为二核苷酸重复。Xgwm372和Xgwm122经琼脂糖凝胶电泳发现,与Lr45的供体黑麦有共同的标记片段,可直接用于分子标记辅助选择。

^(60)Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用^(60)Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义。用^(60)Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化。结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系。5Gy剂量^(60)Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低。PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要。

绵羊脑多头蚴病45m基因在多头绦虫和细粒棘球绦虫不同发育阶段同源性的比较

目的研究绵羊多头蚴病45 M重组蛋白的同源性。方法将多头蚴的45 m基因片段亚克隆到pET41b表达质粒,构建45 m-pET41b原核表达系统,诱导表达45 M重组蛋白,制备小鼠高免血清,进行免疫印迹试验(Western blot);运用RT-PCR的方法,从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45 mA。结果45 M蛋白的高免血清可被细粒棘球绦虫不同发育阶段的天然抗原所识别,均在63kD处发生交叉反应;从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45 m基因的同源基因,命名为45 mA(Gen-Bank号为EU326106),45 m和45 mA的核酸序列和蛋白序列分别有86%和76%的同源性;45 M和45 MA蛋白与细粒棘球蚴的保护性蛋白Eg95有57%的氨基酸同源性。结论提示45 m抗原分子在多头绦虫和细粒棘球绦虫的不同发育阶段均存在,为45 M蛋白的免疫原性的分析提供了宝贵的资料。

电离辐射对人外周血淋巴细胞GADD45基因表达的影响

观察生长抑制和DNA损伤基因45(Growth arrest and DNA damage gene 45,GADD45)X射线照射后表达的改变,并研究其与照射剂量之间的关系。外周血给予0-5 GyX线照射后分离出单个核细胞并培养,在不同时间点上用反转录聚合酶链反应(Reverse transcriptase-Polymerase clain reaction,RT-PCR)的方法测定 GADD45基因的相对表达量,分析该基因的剂量、效应关系。照射后GADD45基因在转录水平表达呈剂量依赖性增加,照射后4h达峰值,以后开始下降,但在24h仍未恢复到初始水平。

小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记

【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45SCAR(sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域)标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本,利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增,对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序,并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF,对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增,验证该标记与Lr45的连锁关系,Mapmaker3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带,片段大小为1272bp(命名为Ypsc20H1272),而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析,遗传距离为8.2cM,该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。

MEPE／OF45蛋白的抗体制备与细胞内定位研究

目的研究MEPE/OF45蛋白(Matrix Extracellular PhosphoglycoprotEin/Osteoblast/Osteocyte Factor 45,MEPE/OF45)的功能,制备MEPE/OF45蛋白抗体并检测其定位。方法通过分子克隆方法体外表达MEPE/OF45蛋白片段,获得大量纯蛋白后免疫小鼠并得到抗体,利用抗体进行免疫荧光染色方法检测MEPE/OF45蛋白在细胞内定位情况。结果得到特异性较高的抗体,并观察到MEPE/OF45蛋白在辐射敏感细胞与抗辐射细胞内定位不同。结论MEPE/OF45蛋白不同辐射敏感型的细胞中定位不同,说明MEPE/OF45蛋白参与细胞辐射后DNA损伤修复过程。

猪带绦虫45W基因家族cDNA克隆和序列分析

根据猪带绦虫45W基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对六钩蚴总RNA进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收,与载体pGEMT-easyVector连接,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,测序。结果显示,已成功克隆到重要保护性抗原45W基因B型转录本cDNA,完整开放阅读框(ORF)的大小为459bp。序列同源性分析与比较表明,所获得的9个B型转录本cDNA除TSO45W-4B-1和TSO45W-4B-2与已报道的TSO45W-4B同源外,其余均属于首次报道的45W基因家族新成员。各cDNA克隆之间核苷酸序列的差异性为1.5%～19.8%,氨基酸序列之间的差异性为2.6%～29.7%,后者比前者的差异程度更大。

猪带绦虫45W-4B基因在家蚕细胞中的表达

猪带绦虫45W基因已被认为是预防猪囊虫病的基因工程疫苗候选基因之一。其中4B基因是45W基因家族中高度保守的一个成员(以下称45W-4B)。本试验将重组于pGEM-3Z载体上的4B基因转载到pVL1393转移载体中,通过鉴定获得重组质粒pVL1393-4B,然后将重组质粒与BmNPV病毒共转染,筛选出重组BmNPV-4B重组病毒,用该重组病毒感染Bm细胞,收集细胞上清,SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白,并经Westernblot检测表明该蛋白能识别囊虫病人(猪)阳性血清,45W-4B蛋白的成功表达对进一步研究45W蛋白的结构和功能以及开发高效猪囊虫基因工程疫苗打下了基础。

Gadd45介导抑癌基因BRCA1诱导的G_2/M期阻滞

背景与目的:目前已经肯定,抑癌基因BRCA1是细胞周期监测点调控的重要因子,但BRCA1在细胞周期阻滞中的作用机制尚不完全清楚。本研究的目的是探讨Gadd45在BRCA1诱导的细胞周期阻滞中所起的作用。方法:应用转染、流式细胞仪细胞筛选(分选)、Westernblot检测分析BRCA1诱导Gadd45的表达;利用CAT酶活性测定的方法检测外源BRCA1对Gadd45启动子所起作用;以流式细胞周期分析方法检测反义Gadd45转染对BRCA1诱导的细胞G2/M期阻滞的影响;采用细胞生长集落形成分析反义Gadd45转染HeLa、HCT116细胞在BRCA1诱导的细胞生长抑制过程所起的作用。结果:外源转染BRCA1可诱导Gadd45蛋白的表达;BRCA1激活Gadd45启动子的转录;反义Gadd45可显著阻遏BRCA1诱导细胞G2/M期阻滞;反义Gadd45转染可明显降低BRCA1对HeLa、HCT116细胞集落形成的抑制作用。结论:Gadd45作为BRCA1的下游调控基因,在BRCA1诱导的细胞G2/M期阻滞过程和生长抑制中起介导作用。

X射线诱导人外周血淋巴细胞GADD45和p21基因表达上调

应用实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,定量分析不同剂量X射线体外照射对人外周血淋巴细胞GADD45和p21基因表达的影响,探讨了运用mRNA水平变化作为电离辐射生物剂量计的可能性。结果表明:经1、2、3、5Gy X射线照射后24h,GADD45和p21基因表达均明显上调。GADD45基因表达在1-5Gy照射剂量范围内呈指数相关。p21基因表达在1-3Gy照射剂量范围内呈线性剂量效应关系,但5.0Gy照射后,其表达不再继续增加。结果表明,X射线照射后人外周血淋巴细胞GADD45和p21基因的表达在一定剂量范围内呈剂量依赖性上调,GADD45更适合发展为核事故受照射人员的分子生物剂量计。

双价转基因抗虫棉中棉所45的丰产性及生理特性研究

以抗虫棉33B和sGK321为对照品种,研究了双价转基因(Bt+CpTI)抗虫棉中棉所45的农艺性状、生理生化特性及产量和纤维品质特性。结果表明:虽然中棉所45的营养生长速率低于33B和sGK321,但其生殖生长速率高于33B和sGK321;中棉所45的CAT和POD活性高于sGK321,低于33B,中棉所45的SOD活性和叶绿素含量显著高于33B和sGK321,而MDA含量低于33B和sGK321;表明中棉所45的抗氧化酶活性较强。中棉所45结铃性强,铃大,衣分高,因而其产量高,纤维品质好。由此说明,中棉所45生长发育协调性较好,叶功能好,早熟不早衰,具有较高的丰产性和抗逆性。