MFS超家族转运蛋白结构基础及转运机制

MFS(major facilitator superfamily)转运蛋白家族是目前已知的最大的膜转运蛋白家族之一.该家族膜转运蛋白广泛存在于整个生物界,其功能也与很多生命活动现象息息相关.作为膜转运蛋白,其基本功能是协助完成物质的跨膜转运.为了更好地理解MFS超家族蛋白如何实现物质的跨膜转运,科研人员致力于对其进行结构生物学研究.至今为止,总共有16个MFS超家族蛋白成员的结构得到解析.有限的结构信息可以提供一些线索,帮助我们理解跨膜物质转运的机制.本文除了介绍MFS超家族蛋白结构生物学和转运机制的研究进展外,还通过对已有结构和转运机制的介绍,实现对将来研究的展望.

盐单胞菌YH-I中MFS超家族转运蛋白基因的克隆、生物信息学分析及其功能初步验证

目的克隆盐单胞菌YH-I的MFS转运蛋白基因,明确其基本的生物学信息,并对其蛋白功能进行分析。方法提取盐单胞菌YH-I的总基因组DNA,应用Sau3AⅠ进行部分酶切,胶回收4 000~10 000 bp片段,与p UC18载体连接。采用功能互补法将连接产物电转化至缺陷株大肠埃希菌EP432感受态细胞中,筛选MFS转运蛋白新基因,进行生物信息学分析。以其为模板,进行PCR扩增后,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,筛选阳性单克隆,接种至LBK液体培养基(Na^+含量控制在0~0.8 mol/L),IPTG诱导表达。结果从盐单胞菌YH-I克隆出全长为4 219 bp的片段,经DNAMAN分析,此片段含有4个开放式阅读框(ORF),提交NCBI进行BLAST比对,其中长度为1 209 bp的ORF2与Halomonas campaniensis(WP_038484815.1)编码的MFS转运蛋白一致性为86%,编码402个氨基酸,预测的相对分子质量为43 000,等电点为9.63。经跨膜预测与疏水性分析,该蛋白定位于细胞膜上,含有12个疏水性跨膜区。经系统发育树分析,来自盐单胞菌YH-I的MFS转运蛋白处于1个独立的分支,可能为新型的MFS转运蛋白成员。经LBK转运能力分析,该蛋白不具有Na^+转运能力。结论本研究对克隆的MFS转运蛋白新基因进行的生物信息学分析及功能初步验证,为进一步明确盐单胞菌YH-I的MFS蛋白功能奠定了基础。

Streptomyces sp.Tü 4128中新型抗生素bagremycins抗性基因bagJ的研究

通过框内敲除鉴定了链霉菌Streptomyces sp.Tü4128中基因bagJ的功能。HPLC结果表明,敲除基因bagJ导致抗生素生产水平大幅降低;回补菌株恢复了抗生素的生产;过表达菌株大幅提高了抗生素的产量,证明基因bagJ在新型抗生素bagremycins的生物合成中必不可少。抑菌圈实验表明基因bagJ敲除菌株较野生菌株对bagremycins更加敏感;BagJ在Streptomyces lividans TK64中异源表达后使该菌株对bagremycins的耐受性增强,证明bagJ是新型抗生素bagremycins的抗性基因。扫描电镜的结果证明了BagJ异源表达后导致Streptomyces TK64的菌丝形态发生了改变。其他抗生素的敏感性实验表明,BagJ可能是一个逆向转运蛋白。

毕赤酵母GT1的原核表达与体外功能鉴定

为了开展体外互作实验,以pXMJ19质粒为载体构建pXMJ19-gt1-His重组质粒,通过单因素优化实验获得毕赤酵母甘油转运体GT 1的最优表达宿主为C41(DE3);最优表达条件为OD 600达到0.7时加入终浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),于30℃、110 r/min诱导10 h。通过超速离心验证了部分GT1蛋白在大肠杆菌中位于细胞质膜上,并筛选得到针对GT1重溶解率最高的去垢剂NP-40。在去垢剂环境下通过镍离子亲和层析纯化得到GT1蛋白,然后利用等温滴定量热法体外检测其与甘油的结合能力,结果表明:GT1与甘油在体外相互作用产生放热反应,且测得其与甘油的平衡解离常数K D值为6.58μmol/L。实验说明原核表达的GT1蛋白具有活性,且与甘油的体外相互作用明显,为GT1以甘油为配体进行结晶以及解析其三维结构提供了研究基础。