基于胃癌MG7-Ag模拟表位基因疫苗的构建

目的 构建以胃癌 MG7- Ag模拟表位为基础的DNA疫苗 .方法 将 H ind 酶切位点、MG7- Ag模拟表位和通用性辅助性 T细胞 (Th细胞 )表位编码序列的反向互补序列顺次设计于下游引物中 ,通过 2次聚合酶链式反应将 2种表位连接于一段载体基因 ,H ind 酶切位点位于载体片段与表位基因之间 .将目的基因插入 p UCm - T载体 ,酶切鉴定和序列测定证实后 ,利用 p UCm- T载体和 pc DNA3.1(+)载体共有的 Kpn 和 Xba 酶切位点 ,将目的基因亚克隆入真核表达载体 pc DNA3.1(+)载体 .酶切鉴定后 ,利用目的基因和pc DNA3.1(+)载体上的 H ind 酶切位点 ,H ind 酶切去除载体基因片段 ,得到胃癌 MG7- Ag模拟表位和通用性 Th细胞表位的真核表达载体 .结果 经序列测定证实 :PCR产物为载体基因、H ind 酶切位点、MG7- Ag模拟表位及通用性Th细胞表位的融合片段 ;最终得到的重组 pc DNA3.1(+)质粒含有正确编码以上 2种表位的基因片段 .结论 以胃癌MG7- Ag模拟表位为基础的 DNA疫苗构建成功 。

表达胃癌MG7-Ag模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗的研制和初步鉴定

目的 研制可表达胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗。 方法将ＮｃｏⅠ位点和ＭＧ７－Ａｇ模拟表位编码序列的互补序列设计到上游引物的５′端。以含有ＨＢｃＡｇ全序列的质粒ｐ１．２Ⅱ为模板，通过ＰＣＲ扩增，获得ＭＧ７－Ａｇ模拟表位与ＨＢｃＡｇ的融合基因。将目的基因插入载体ｐＵＣｍ－Ｔ，经酶切鉴定和序列测定证实后，再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０互补的质粒ｐＹＡ３３４１中，再以此重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０。结果序列测定证实，ＰＣＲ产物为胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位与ＨＢｃＡｇ的融合基因片段；最终得到含有目的基因片段的重组表达载体ｐＹＡ３３４１。重组质粒在Ｘ４５５０中的表达产物，经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明，在相对分子质量（Ｍｒ）约在２２ ０００处有１条可与抗ＭＧ７ ｍＡｂ特异性结合的多肽表位。结论成功地研制可表达胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位减毒鼠伤寒杆菌疫苗，为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。

利用细菌内重组腺病毒系统构建胃癌MG7-Ag模拟表位疫苗

目的:以复制缺陷的腺病毒为疫苗载体,构建基于胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒疫苗.方法:将编码MG7-Ag模拟表位的互补序列设计到上游引物的5/端.以含有HBcAg全序列的质粒p1.2Ⅱ为模板,通过PCR扩增,获得MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因.经序列测定证实后,亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组.经抗性筛选及酶切鉴定的重组质粒,再用导入293细胞进行包装,利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达.结果:序列测定证实,PCR产物为胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片段;酶切鉴定表明胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片断插入了pAdTrack-CMV穿梭质粒,卡那霉素进行抗性筛选及PacⅠ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.PacⅠ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论:胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒载体的构建成功,为进一步研究胃癌MG7-Ag模拟表位诱发抗胃癌免疫打下了基础.

人乳头瘤病毒16型E7抗原细胞毒性T细胞预测表位的分子模拟研究

对人乳头瘤病毒(HPV)16型E7抗原的预测表位从理论上分析其与HLA-A2分子结合的情况,推测成为HLA-A2限制性表位的可能性。通过计算机分子模拟,确立各表位及其与HLA-A2分子结合形成复合物的模拟结构。结果发现,各表位的三维结构符合HLA-A2限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位的结构要求,能较好地与HLA-A2分子结合。根据分子模拟提供的理论支持,各预测表位均符合要求,提示可在后续实验中进行表位合成、筛选、鉴定和多肽疫苗的研制。

猪轮状病毒VP7蛋白模拟表位的噬菌体展示技术筛选与鉴定

猪轮状病毒（Po RV）是引起仔猪腹泻的重要病原之一,其主要结构蛋白衣壳蛋白VP7可诱导机体产生中和抗体。文章以制备的抗Po RV VP7单克隆抗体（MAb）3B6作为靶分子,利用噬菌体十二肽库展示技术对其模拟表位进行筛选。四轮筛选后随机挑取阳性克隆扩增后进行ELISA鉴定,同时提取其基因组DNA测序,10个阳性噬菌体亲和肽拥有共同的外源肽序列＂VPLGTDNGDIWV＂,而且与靶分子有很高亲和力。阳性噬菌体亲和肽与VP7蛋白进行序列比对,结果表明,十二肽中有4个氨基酸（第167位P、第178位T、第179位D和第184位W）与VP7蛋白167-184位氨基酸有一定的相似性。竞争抑制ELISA证明亲和多肽降低Po RV与抗VP7单克隆抗体之间的作用,病毒竞争抑制试验表明亲和多肽可以竞争性地抑制Po RV感染细胞。因此由这4个氨基酸构成的基序很有可能作为猪轮状病毒VP7蛋白的一个模拟表位。

丙型肝炎病毒高变区1模拟表位7肽细胞免疫应答作用的研究

目的探讨丙型肝炎病毒高变区1模拟表位7肽在体外刺激免疫小鼠脾淋巴细胞后的细胞增殖情况。方法选用经7肽皮下多点免疫和脾内直接注射两种免疫途径的免疫小鼠,无菌条件下分离脾淋巴细胞后,实验组分为刺激组与未刺激组,刺激组脾细胞再经7肽刺激,应用单溶液细胞增殖检测法体外检测7肽对免疫小鼠脾淋巴细胞在不同浓度和不同培养时间点增殖的影响。结果体外7肽刺激免疫小鼠脾淋巴细胞后,刺激组的脾淋巴细胞增殖反应与未刺激组比较存在促进作用,与对照组比较出现了明显的增殖反应。结论丙型肝炎病毒高变区1合成肽在体外对免疫小鼠脾淋巴细胞具有一定的促增殖作用。

噬菌体7肽库中筛选细粒棘球蚴头节抗原的模拟表位的初步研究

目的:从噬菌体 7肽库中寻找细粒棘球蚴头节抗原的模拟表位。方法 :以细粒棘球蚴头节抗原的单克隆抗体作靶分子筛选噬菌体 7肽库 ,经过第 3轮筛选后进行 EL ISA检测及竞争抑制试验后 ,挑取 9株阳性克隆进行序列测定 ,序列比较后得到保守序列。结果 :经过第 3轮亲和筛选 ,阳性克隆得到富集。EL ISA检测和竞争抑制试验证明 ,该小肽具有良好的免疫活性和特异性。结论:肽片段可能是细粒棘球蚴头节抗原的抗原表位 。

MUC1抗原的表位预测及模拟位的筛选

目的预测MUC1抗原的B细胞表位,从噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟位。方法联合运用多种方法对MUC1的二级结构和表面特性,如理化性质、亲水性、可塑性、溶剂可及性及免疫原性等方面进行分析,预测MUC1的抗原表位。利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列,竞争性抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆。结果MUC1存在有多个潜在的抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:110,2454,6577,8491,108134,140156,159174,179196,199210,220233,237265,270299,316337,351362,369396,411420,445502。经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论应用多参数预测MUC1抗原的B细胞表位,为进一步研究MUC1结构和功能、选择表达新型MUC1分子奠定了基础。所得序列TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。

胃癌MG_7-Ag模拟表位口服DNA疫苗的研制

目的 利用减毒鼠伤寒沙门氏菌研制胃癌MG7 Ag模拟表位的口服DNA疫苗 ,并观察其对小鼠的免疫效能及保护作用。方法 构建MG7 Ag模拟表位和通用性辅助性T细胞表位融合基因的真核表达载体。将真核表达载体转入减毒鼠伤寒沙门氏菌得到模拟表位的口服DNA疫苗。以 1× 10 8cfu疫苗菌口服免疫C5 7BL/6J小鼠 ,以携带空载体的沙门氏菌和PBS口服作为对照。以ELISA法检测小鼠血清中抗MG7 Ag抗体的滴度 ,以H TDR掺入法检测小鼠脾淋巴细胞对人工合成的MG7 Ag抗原肽刺激的增殖能力。同时 ,用表达MG7 Ag的小鼠艾氏腹水瘤细胞进行肿瘤攻击 ,观察疫苗对小鼠的保护作用。结果 口服疫苗可诱导小鼠产生MG7抗体 ,但各组小鼠脾淋巴细胞体外刺激增殖实验差异无显著性。肿瘤攻击 2周后 ,疫苗免疫组 7只小鼠中有 2只未见肿瘤形成 ,而对照组 4只小鼠则全部成瘤。结论 胃癌MG7 Ag模拟表位的口服DNA疫苗具有免疫原性 ,可以诱导小鼠产生抗肿瘤免疫 。

HPV-58型E7蛋白抗原模拟表位的筛选及分析

利用该实验室成熟的噬菌体随机十二肽库筛选平台,对HPV-58型E7蛋白单克隆抗体株4C4a、6C7a进行3轮亲和筛选,得到2组、各8个阳性噬菌体克隆.阳性噬菌体氨基酸序列用以模拟单抗(靶蛋白)特异性识别的HPV-58型E7蛋白的抗原表位.将测得的阳性噬菌体多肽序列及HPV-58型E7蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析后,进行线性序列比对及构象性表位预测及分析.构象性表位的预测借力于Epi Search Server和Pepitope Server,对构象性表位匹配及簇的寻找提供有力支持,也为早期诊断及研制多肽疫苗提供参考.

人乳头瘤病毒16E7_(49-57)的分子修饰与鉴定

目的对人乳头瘤病毒(HPV)16型E7抗原的人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞表位HPV16E749-57进行氨基酸置换修饰,并鉴定修饰表位。方法运用量化模体方案对置换后的多肽与人白细胞抗原A2分子的结合系数进行比较,以分子模拟方法确定合成序列,采用标准Fmoc方案进行合成与纯化多肽以及乳酸脱氢酶释放法检测特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结果修饰多肽符合人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞的表位要求,9肽RLHYNIVTF具有特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结论修饰表位(氨基酸序列RLHYNIVTF)具有更好的结合力和较强的抗原性,可以代替原有序列E749-57(氨基酸序列RAHYNIVTF)作为人乳头瘤病毒感染治疗性肽疫苗分子设计的候选表位。