用TaqMan-MGB荧光探针法检测北京地区幽门螺杆菌A2142G/A2143G耐药突变

目的用Taq Man-MGB荧光探针法检测北京地区幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142G、A2143G突变情况。方法收集北京大学人民医院消化科门诊尿素酶试验及病理活检均阳性的患者233例,所有患者均应用MGB荧光探针法和一代测序法对耐药位点A2142G/A2143G进行检测,其中79例患者同时进行传统培养联合药敏法检测。分析耐药位点突变发生率与患者年龄、性别和消化性溃疡的关系。结果 79例传统培养联合药敏法检测的标本中成功培养出42例,占53%（42/79）,其中耐药型菌株22例,敏感型菌株20例,而MGB荧光探针法成功检出77例,占97%（77/79）,其中野生型28例,突变型49例。在传统培养＋药敏法培养出的42例阳性标本中,两种方法检出的符合率为86%（36/42）。233例标本中,一代测序法成功检测出214例,占92%（214/233）,其中野生型138例,突变型76例。在76例突变型标本中,含A2142G突变（包括A2142G和A2142G＋野生）的标本占5%（4/76）,含A2143G突变（包括A2143G和A2143G＋野生）的标本占95%（72/76）。MGB荧光探针法成功检测出231例,占99%（231/233）,其中野生型141例,突变型90例。在90例突变型标本中,含A2142G突变的标本占14%（13/90）,含A2143G突变的标本占86%（77/90）。一代测序法和MGB荧光探针法在区分是否含有突变上的符合率为95%（203/214）。根据MGB荧光探针法检测结果将患者分为突变组与野生组,2组在年龄和性别上差异无统计学意义（t年龄=-0.685,P=0.493;χ-2性别=0.065,P=0.890）,而在消化性溃疡发生率上差异存在统计学意义（χ2=6.653,P=0.044）。结论TaqMan MGB荧光探针法可应用于临床快速、敏感地检测患者胃黏膜标本中幽门螺杆菌克拉霉素A2142G、A2143G耐药位点突变情况。

TaqMan-MGB荧光探针法检测北京地区幽门螺杆菌gyrA基因第87位密码子和第91位密码子耐药突变

目的采用TaqM an-MGB荧光探针法检测北京地区幽门螺杆菌喹诺酮类耐药位点gyr A基因第87位密码子和第91位密码子突变情况,比较与药敏试验和一代测序法的一致性。方法收集北京大学第一医院消化内科门诊尿素酶试验阳性的患者252例,所有患者均使用MGB荧光探针法和一代测序法对喹诺酮类耐药位点gyr A基因第87位密码子和第91位密码子进行检测。其中158例患者同时进行药敏试验检测,同时分析耐药位点突变发生率与耐药表型的关系。结果 158例传统培养联合药敏法检测的标本中成功培养出85例,占53.8%,其中耐药型菌株40例,敏感型菌株42例。而MGB荧光探针法成功检出155例,占98.1%,其中野生型93例,突变型62例。在药敏试验检测出的85例阳性标本中,两种方法检出的符合率为94.1%。252例标本中,一代测序法成功检测出234例,占92.9%,其中野生型160例,突变型74例。在74例突变型标本中,含gyr A基因第87位密码子突变的标本占60.8%,含gyr A基因第91位密码子突变的标本占39.2%。MGB荧光探针法成功检测出250例,占99.2%,其中野生型161例,突变型89例。在89例突变组标本中,含gyr A基因第87位密码子突变的标本占64.0%,含gyr A基因第91位密码子突变的标本占36.0%。一代测序法和MGB荧光探针法在区分是否含有突变上的符合率为95.3%。结论 Taq Man-MGB荧光探针法可快速、敏感地检测患者胃黏膜标本中幽门螺杆菌喹诺酮类耐药位点gyr A基因第87位密码子和第91位密码子的突变情况,与药敏试验和一代测序法有较高的符合性。

荧光MGB探针实时PCR检测经典型苯丙酮尿症的基因突变

【目的】探讨荧光MGB探针实时PCR技术检测经典型苯丙酮尿症的基因突变。【方法】运用荧光MGB探针实时PCR检测经典型苯丙酮尿症33例,一级亲属43例,正常对照30例。检出R243Q突变的PCR标本进行测序验证。【结果】发现11例PKU具有R243Q突变,突变频率为33%,其中突变纯合子4例,突变杂合子7例,一级亲属检出R243Q杂合子突变9例,正常人未发现R243Q突变。所有突变均经测序证实。【结论】PAH基因第7外显子的R243Q点突变在中国PKU患者中有较高的突变率;荧光MGB探针实时PCR是PKU的基因诊断良好技术平台。

犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R^2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。

MGB双荧光探针检测IDH1基因突变

目的建立一种快速检测异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)基因单核苷酸多态性的MGB双荧光探针检测方法,并验证该方法检测灵敏度与直接测序方法的一致性。方法构建携带IDH1基因的野生型(R132)和突变型(H132)质粒,并使用质粒优化MGB双荧光探针检测。使用预先已知不同比例的IDH1野生型和突变型质粒作为检测模版,确定IDH1基因突变检测方法的灵敏度。针对56例胶质瘤病人手术切除标本的组织基因组DNA,分别使用直接测序法和MGB双荧光探针检测法,鉴定比较IDH1基因突变类型。结果使用MGB双荧光探针法能够快速准确的检测IDH1基因突变。直接测序检出突变阳性率为26.79%,MGB双荧光探针法检出突变阳性率为30.36%。Kappa检验显示两种方法检测结果一致(P<0.001,K=0.956)。结论 MGB双荧光探针法检测胶质瘤基因组DNA中IDH1基因突变灵敏可靠,操作方便快捷,适合于临床快速分子诊断分析。

鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV)的非结构蛋白2(Nsp2)基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescent quantitative RTPCR)检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LPPRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达101拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。

纤维蛋白原及其相关基因β148和β854多态性与冠心病发病的相关性

目的探讨纤维蛋白原及其相关基因β148、β854多态性与冠心病的关系。方法1254例冠状动脉造影检查者,按造影结果随机分组,冠状动脉管腔狭窄≥50%者为冠心病组,共836例;冠状动脉管腔狭窄<50%者确定为对照组,共418例。取静脉血检查血脂(标准酶法)、血浆纤维蛋白原(凝血酶法)水平和肝、肾功能等。纤维蛋白原基因β148、β854多态性位点检测采用TaqManMGB探针荧光标记聚合酶链反应方法,扩增目的基因片段,然后利用荧光发光特点,经由7900HT基因分析仪进行多态位点分析。结果在1254例研究对象中,纤维蛋白原基因β148多态性位点检测成功1219例(97.2%),β854多态性位点检测成功1225例(97.7%)。与对照组比较,冠心病组年龄偏大,以男性多见,吸烟、高血压、糖尿病例次增多,甘油三酯、脂蛋白(a)和血浆纤维蛋白原均明显增高,高密度脂蛋白胆固醇明显降低(P<0.01),但总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及纤维蛋白原β148、β854基因型及等位基因频率分布均无显著性差异(P>0.05)。Spearman’s相关分析发现,冠心病与纤维蛋白原β148、β854基因型之间无相关性(P>0.05),而与年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白(a)和血浆纤维蛋白原之间存在显著相关性(P<0.01)。血浆纤维蛋白原与其基因β148、β854多态性之间无相关性(r=0.31,P>0.05)。结论除高血压、糖尿病等冠心病传统危险因素外,血浆纤维蛋白原与冠心病发病有明显关系,但不受其相关基因β148、β854多态性的影响。