RNA干扰β-catenin基因对二氧化硅诱导的MH-S细胞中基质金属蛋白酶表达的影响

目的观察β-catenin短发夹RNA干扰(shRNA)重组慢病毒对二氧化硅诱导的小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S细胞中基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMP)9表达的影响。方法将MH-S细胞分为4组:空白细胞对照组(MH-S)、SiO_2诱导组(silica)、病毒干扰组(silica+LV-shβ-catenin)、病毒对照组(silica+LV-shβ-catenin-NC),除空白细胞对照组外,各组细胞均用终浓度为200μg/ml的SiO_2刺激,培养18 h后,western blot检测各组细胞β-catenin和MMP9蛋白表达水平,realtime-PCR检测各组细胞MMP9 mRNA水平。结果 SiO_2诱导后,与silica组和silica+LV-shβ-cateninNC组比较,silica+LV-shβ-catenin组β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.05);realtime-PCR和western blot检测结果显示,silica+LV-shβ-catenin组细胞中MMP9的mRNA和蛋白表达较silica组和silica+LV-shβ-catenin-NC组均显著降低(P<0.05)。结论重组慢病毒LV-shβ-catenin能够有效抑制经SiO_2诱导的MH-S细胞株β-catenin蛋白表达,并对MMP9的表达有明显抑制作用。

慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清对PM2.5所致MH-S细胞炎症的影响及salubrinal的作用

目的:探讨慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者血清和salubrinal在细颗粒物(PM2.5)诱导的小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S炎症中的作用。方法:(1)将MH-S细胞分为对照组、PM2.5组、AECOPD患者血清组、健康志愿者血清组、PM2.5+AECOPD患者血清组和PM2.5+健康志愿者血清组,检测组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2)活性,细胞上清液中白细胞介素17(IL-17)浓度,分析IL-17与HDAC2活性间的相关性;(2)进一步探究salubrinal对PM2.5刺激的MH-S细胞的作用,分为对照组、PM2.5组和salubrinal+PM2.5组,检测MH-S细胞中C/EBP同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达、HDAC2活性及细胞上清液中IL-17浓度。结果:(1)PM2.5组、AECOPD患者血清组、健康志愿者血清组和PM2.5+AECOPD患者血清组和PM2.5+健康志愿者血清组较对照组MH-S细胞HDAC2活性均降低,IL-17分泌增加,且AECOPD患者血清组较健康志愿者血清组IL-17升高,MH-S细胞HDAC2活性降低更明显(P<0.05)。PM2.5+AECOPD患者血清组较PM2.5+健康志愿者血清组IL-17升高、HDAC2活性降低明显(P<0.05)。IL-17与HDAC2之间存在负相关(r=-0.786,P<0.01);(2)PM2.5刺激12 h后细胞较对照组CHOP荧光增强、核内居多,GRP78荧光增强、胞质明显,IL-17含量增加,HDAC2活性降低(P<0.05)。加入salubrinal干预后CHOP荧光较PM2.5组减弱,GRP78荧光较PM2.5组增强,IL-17含量降低,HDAC2活性增加(P<0.05)。结论:PM2.5刺激会导致MH-S细胞IL-17分泌增多,HDAC2活性降低,血清会加重PM2.5对MH-S细胞的影响;IL-17与HDAC2之间存在负相关;PM2.5刺激使CHOP和GRP78表达增多,激活MH-S细胞内质网应激;salubrinal可能通过下调MH-S细胞CHOP表达抑制了PM2.5对MH-S细胞炎症功能。

IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路增强小鼠肺泡巨噬细胞的吞噬功能

目的 探讨白细胞介素6(IL-6)对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响及其相关机制。方法 脂多糖(LPS)经气道滴入激发构建小鼠急性肺损伤(ALI)模型,ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-6的含量。体外培养MH-S细胞,在信号转导子与转录激活子3 (STAT3)抑制剂Stattic(5μmol/L)存在与否的情况下,再加入IL-6(10 ng/mL~500 ng/mL)刺激6 h,加入荧光微球孵育2 h后,采用流式细胞术检测MH-S细胞吞噬荧光微球情况;Western blot法检测磷酸化的Janus激酶2(p-JAK2)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)、肌动蛋白相关蛋白2(Arp2)、纤维型肌动蛋白(F-actin)的表达水平。结果 鼻腔滴入LPS后,小鼠BALF中IL-6含量显著升高。随着IL-6刺激剂量的增加,MH-S细胞吞噬荧光微球的作用增强,Arp2、 F-actin蛋白的表达水平升高。100 ng/mL IL-6刺激MH-S细胞后,p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达水平升高。阻断MH-S细胞STAT3信号后,IL-6促进细胞吞噬的效应完全消失,IL-6诱导的Arp2、 F-actin蛋白表达增加被抑制。结论 IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路促进MH-S细胞Arp2、 F-actin蛋白的表达增强吞噬功能。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路探讨参芪调肾方改善CSE诱导小鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的作用机制

目的:基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路探讨参芪调肾方(SQTS)改善香烟烟雾提取物(Cigarette smoking extract,CSE)诱导小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)炎症反应的作用机制。方法:以MH-S细胞为研究对象,通过CCK-8法分析SQTS对MH-S细胞的安全性及药效浓度;随后MH-S分为空白组、模型组(8%CSE)和SQTS低、中、高剂量组(40、80、160 mg/L)。ELISA检测细胞上清TNF-α、IL-1β和IL-6含量;DCFH-DA荧光探针法检测细胞中ROS水平;Westernblot检测TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白的表达,使用TLR4抑制剂TAK-242验证SQTS在TLR4/NF-κB/NLRP3通路上的作用。结果:与空白组比较,CSE组细胞活力降低,炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量增加(P<0.05),ROS荧光表达水平显著升高(P<0.01),TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组比较,参芪调肾方各剂量组细胞活力升高,以上各指标表达水平均有所降低(P<0.05),且TAK-242各组细胞TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白减少(P<0.05)。结论:参芪调肾方可减轻CSE诱导的MH-S细胞的炎症反应,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路有关。

PM2.5对AECOPD和ACO患者血清作用的肺泡巨噬细胞炎症的影响及其机制

目的:探讨PM2.5刺激对慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbation chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)及哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠(asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap,ACO)患者血清孵育的肺泡巨噬细胞(MH-S)的影响及PM2.5致巨噬细胞炎症与SIRT1/NF-κB信号通路的关系。方法:首先将细胞分为对照组、PM2.5组、AECOPD组、ACO组、PM2.5+AECOPD组和PM2.5+ACO组,培养MH-S细胞6 h,收集细胞上清液,ELISA检测不同组之间白细胞介素6(IL-6)和IL-10浓度的差异。然后,为探究PM2.5致巨噬细胞炎症与SIRT1/NF-κB通路的关系,进一步将MH-S细胞分为对照组、PM2.5组、PM2.5+SRT2104组和PM2.5+EX527组,检测细胞沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator 2-related enzymes 1,SIRT1)、NF-κB P65、p-P65、IκB和p-IκB蛋白的水平,以及细胞上清液中IL-6和IL-10的浓度。结果:与对照组相比,PM2.5组、AECOPD组、ACO组、PM2.5+AECOPD组和PM2.5+ACO组的IL-6浓度均升高,IL-10浓度均降低,其中ACO组较AECOPD组的变化更明显(P<0.05)。与PM2.5+AECOPD组相比,PM2.5+ACO组的IL-6升高更明显(P<0.05)。PM2.5刺激细胞12 h后,SIRT1、IκB和p-IκB的蛋白水平减少,P65和p-P65的蛋白水平增加(P<0.05);加入SIRT1激活剂SRT2104,SIRT1的表达升高,p-P65蛋白水平降低,IL-6浓度降低,IL-10浓度升高(P<0.05);加入SIRT1抑制剂EX527,SIRT1的表达减少,P65和p-P65蛋白水平升高,IL-6浓度升高,IL-10浓度降低(P<0.05)。结论:PM2.5可以通过SIRT1/NF-κB信号通路致MH-S细胞炎症,且PM2.5对ACO患者的致炎作用可能高于AECOPD患者。

茶多酚通过调控XB130对LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞炎症因子表达的影响

目的:研究茶多酚(TP)对肺炎小鼠肺泡巨噬细胞炎症因子表达的影响及潜在作用机制。方法:用脂多糖(LPS)诱导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S 12h建立小鼠肺泡巨噬细胞炎症模型。将MH-S细胞分为对照组(LPS处理)和TP组(LPS+TP处理)、pcDNA3.1-NC组(转染pcDNA3.1-NC+LPS处理)、pcDNA3.1-XB130组(转染pcDNA3.1-XB130+LPS处理)、si-NC组(转染si-NC+LPS处理)、si-XB130组(转染si-XB130+LPS处理)、TP+si-NC组(转染si-NC+LPS+TP处理)和TP+si-XB130组(转染si-XB130组+LPS+TP处理),qRT-PCR检测XB130 mRNA表达,Western blot检测XB130表达以及白细胞介素6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌。结果:与对照组相比,TP组MH-S细胞IL-6、IL-1β、TNF-α分泌量显著降低(P<0.05),XB130 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05)。与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-XB130组MH-S细胞IL-6、IL-1β、TNF-α分泌量显著降低,XB130蛋白表达显著升高(P<0.05)。与si-NC组比较,si-XB130组MH-S细胞IL-6、IL-1β、TNF-α分泌量显著升高,XB130蛋白表达显著降低(P<0.05)。与TP+si-NC组比较,TP+si-XB130组MH-S细胞IL-6、IL-1β、TNF-α分泌量显著升高,XB130 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:茶多酚可降低LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞炎症因子表达水平,其机制与上调XB130表达有关。

昆布多糖通过调节巨噬细胞极化延缓肺纤维化研究

目的探索昆布多糖基于调节巨噬细胞极化抑制肺纤维化的作用机制。方法将昆布中提取的硫酸多糖经自由基降解,得到低相对分子质量昆布多糖(low molecular weight fucoidan,LMWF),并通过高效液相色谱测定了其单糖结构组成。通过免疫组化检测肺纤维化小鼠与LMWF治疗组小鼠M2巨噬细胞极化生物标志物的表达,并通过Western blotting和qRTPCR检测M1/M2标志物的表达。分别用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)联合γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)诱导MH-S细胞,构建体外M1和M2巨噬细胞极化模型,探索LMWF调节巨噬细胞极化延缓肺纤维化的作用机制。结果LMWF可显着降低肺纤维化小鼠肺组织中M1/M2巨噬细胞标志物的表达(P<0.05、0.01、0.001)。同样,LMWF可有效抑制细胞模型中M1和M2型标志物的表达(P<0.05、0.01、0.001)。结论LMWF可以通过早期抗炎作用调节M1巨噬细胞极化,并在后期通过抑制M2巨噬细胞极化有助于减少纤维化。

冷刺激对小鼠肺泡巨噬细胞表型的影响

目的 探讨冷刺激对小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)表型的影响。方法 将MH-S细胞置37℃培养24 h,于36、34、32℃分别冷刺激0、0.5、1、3、6、9、12 h,qRT-PCR法检测MH-S细胞中炎性因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及白介素-10(interleukin-10,IL-10)基因mRNA转录水平。将MH-S细胞置37℃培养24 h,于34℃冷刺激0.5 h,qRT-PCR法检测MH-S细胞中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、精氨酸酶(Arginase1,Arg1)基因mRNA转录水平(以冷刺激0 h为对照);免疫荧光法检测iNOS和Arg1的表达情况(以37℃培养0.5 h的MH-S细胞为阴性对照);Western blot法检测iNOS、TNF-α及核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的表达水平(以37℃培养0.5 h的MH-S细胞为阴性对照)。结果 34℃培养0.5 h条件下,MH-S细胞中IL-1β及IL-10基因mRNA转录水平最高,因此采用该条件建立MH-S细胞的冷刺激模型。与0 h比较,34℃培养0.5 h的MH-S细胞中iNOS、TNF-α和Arg1基因mRNA转录水平均明显升高(t分别为3.733、12.190、6.793,P均<0.05)。与阴性对照组比较,刺激组MH-S细胞中iNOS及Arg1的荧光表达强度均有所增强,其中iNOS增强更为明显。与阴性对照组比较,刺激组MH-S细胞中iNOS和TNF-α蛋白表达水平升高,但差异无统计学意义(t分别为0.675和1.514,P均> 0.05);NF-κB表达水平明显升高(t=3.092,P <0.05)。结论 34℃冷刺激0.5 h可提高MH-S细胞中IL-1β、IL-10、TNF-α、iNOS、Agr1、NF-κB等炎性相关因子的表达,可激活MH-S细胞中的NF-κB信号通路,诱导炎症蛋白表达,促进细胞活化。