Crystal Structure of the MH2 domain of Drosophila Mad

The decapentaplegic(Dpp),a member of the TGF-β superfamily,plays a pivotal role in the control of proliferation,global patterning and induction of specific cell fates during Drosophila development.Mother against Dpp(Mad) is the founding member of the conserved Smad protein family which spe-cifically transduces the intracellular TGF-β signaling cascade.Here we report the 2.80 structure of the MH2 domain of Mad(Mad-MH2) that was readily superposed to the mammal Smad-MH2 structures.This unphosphorylated Mad-MH2 forms a symmetric homotrimer in crystals,consistent with the result of the size-exclusion chromatography that Mad-MH2 exhibited a propensity for concentration-dependent oligomerization prior to phosphorylation.Structural analysis revealed that the formation of homotrimeric Mad-MH2 is mainly mediated by contacts involving the extreme C-terminal SSVS motif,and is strengthened by phosphorylation of the last two Ser residues which was confirmed by the gel filtration analysis of the pseudophosphorylated Mad-MH2(DVD).Intriguingly,the homotrimer within an asymmetric unit only possesses two ordered C-terminal tails,reminiscent of the arrangement of the R-Smad/Smad4 complexes,indicating that the subunit with a flexible SSXS motif would be readily replaced by Co-Smad to form a functional heterotrimer.

人牙乳头细胞Smad1基因MH2结构域的cDNA的分子克隆

目的 :从人牙乳头细胞内克隆骨形成蛋白 (BMP)细胞内信号转导基因 Smad1的功能性结构域— MH2结构域。方法 :原代培养人牙乳头细胞 ,从培养的细胞中提取总 RNA,逆转录合成 c DNA第 1条链 ;设计上下游引物 ,进行 RT- PCR,扩增 Smad1基因 MH2结构域的基因片段 ;将所获得的基因片段定向插入 PUC19载体 ;转化大肠杆菌 JM10 9,挑选阳性克隆 ,鉴定后进行序列测定。结果 :获得的 Smad1MH2 结构域的 c DNA片段大小为 44 4bp,并且成功构建 PU C19/ MH2重组质粒。结论 :人牙乳头细胞内存在 Smad1信号转导途径 ,BMP调控人牙乳头细胞分化可能是通过

人牙髓细胞Smad2基因MH2结构域的cDNA克隆和序列测定

目的：从人牙髓细胞内克隆转化生长因子－β特异的细胞内信号转导基因Ｓｍａｄ２的功能性结构域———ＭＨ２结构域。方法：原代培养人牙髓细胞，从培养的细胞中提取总ＲＮＡ，逆转录合成ｃＤＮＡ第１条链；设计内、外侧两对引物，进行巢式ＰＣＲ，扩增Ｓｍａｄ２基因ＭＨ２结构域的基因片段；将所获得的基因片段定向插入ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ（＋）载体；转化大肠杆菌ＪＭ１０９，挑选阳性克隆并鉴定；用ＰＥ３１７－Ａ型自动测序仪进行核苷酸序列测定分析。结果：测序结果与国外从人肾ｃＤＮＡ文库中克隆的基因序列完全一致。结论：首次从人牙髓细胞中克隆成功Ｓｍａｄ２基因的ＭＨ２结构域，证实了Ｓｍａｄ２基因在人牙髓细胞中的表达；提示人牙髓细胞内存在Ｓｍａｄ２信号转导途径，ＴＧＦ－β对人牙髓细胞分化的调节可能是通过Ｓｍａｄ２信号转导途径实现的。

人腱细胞Smad2、Smad4基因MH2结构域的克隆和序列鉴定

目的从人腱细胞内克隆转化生长因子－β特异的细胞内信号转导基因Ｓｍａｄ２、４的功能性结构域－ＭＨ２结构域。 方法 原代培养人腱细胞，从培养的细胞中提取总 ＲＮＡ，逆转录合成单链 ｃＤＮＡ；设计引物进行 ＰＣＲ，扩增 Ｓｍａｄ２、４基 因ＭＨ２结构域的基因片段，将其定向插入ｐＧＥＭ－Ｔ载体，转化大肠杆菌ＤＨ５α。挑选阳性克隆并进行核苷酸序列测定 分析。结果测序结果与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中克隆的基因序列完全一致。结论从人腱细胞中克隆成功 Ｓｍａｄ２、４基因的 ＭＨ２结 构域，证实了 Ｓｍａｄ２、４基因在人腱细胞中的表达；提示人腱细胞内存在 ＳＭＡＤ２、４信号转导途径，ＴＧＦ－β对人腱细胞 分化的调节可能是通过ＳＭＡＤ２、４信号转导途径实现的。

细粒棘球蚴SmadC蛋白及其MH2结构域酵母双杂交载体的构建及自激活鉴定

从重组克隆载体pMD18-T-egsmadC中扩增细粒棘球蚴egsmadC基因及其MH2编码序列,将其克隆入酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7中,经PCR、限制性酶切鉴定及序列测定正确后,PEG/LiAc法转化酵母菌株,测定融合蛋白对酵母菌生长的影响和自激活活性。结果表明,egsmadC基因及其MH2编码序列表达的蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性和自激活作用,可为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定基础。