靶向CⅡTA基因siRNA对大鼠角膜基质细胞MHCⅡ基因表达影响的研究

目的:探讨靶向主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类抗原转录激活因子(MHCⅡtransactivator CⅡTA)的化学合成小干扰RNA(small interfering RNA)抑制大鼠角膜基质细胞表面的MHCⅡ类抗原表达的可行性。方法:设计并合成靶向CⅡTA基因的5条siRNA,分离并培养大鼠角膜基质细胞,经重组大鼠IFN-γ刺激后,在阳离子脂质体的介导下,将siRNA转染大鼠角膜基质细胞。于转染后24h收集细胞,用荧光定量PCR方法检测CⅡTA和MHCⅡmRNA水平的变化;流式细胞仪检测MHCⅡ抗原表达的变化。结果:大鼠角膜基质细胞经重组大鼠IFN-γ刺激后,CⅡTA和MHCⅡ的表达大幅增强。荧光定量PCR检测显示化学合成的5条siRNA通过脂质体转染大鼠角膜基质细胞后,均能不同程度地抑制CⅡTA和MHCⅡ的表达,与对照组具有显著差异(P<0·01)。其中siRNA-4组的抑制作用最明显,对CⅡTA、MHCⅡ基因的mRNA抑制率分别为95·10%±1·25%、82·70%±1·95%。流式细胞仪检测显示siR-NA-4组对MHCⅡ抗原分子表达抑制率为81·90%±1·23%。结论:在大鼠角膜基质细胞中,靶向CⅡTAsiRNA抑制了自身mRNA表达,并阻止其调控的MHCⅡ类分子的相应表达。从而为进一步研究利用siRNA技术抑制MHCⅡ的表达防治角膜缘移植排斥反应提供了实验依据。

抗CⅡTA的核糖核酸酶P对Jurkat细胞MHCⅡ类分子表达的抑制作用

本研究旨在探讨抗MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)的M1-RNA抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达。M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CⅡTA第3408位点的M1-RNA(M1-3408-GS)及其相应的CⅡTA靶基因片段(3176-3560),分别插入pUC19、pGEM-7zf(+)载体,进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作用明显的M1-3408-GS亚克隆入psNAV载体并稳定转染Jurkat细胞株,采用流式细胞术检测该细胞表面经典的MHCⅡ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平。结果表明:在重组人干扰素(IFN)-γ诱导下,M1-3408-GS阳性Jurkat细胞株与对照组比较,其表面HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ抗原诱导型表达分别降低了83.17%、94.12%及84.31%;同时CⅡTA的mRNA含量明显降低(P<0.05,t=4.89)。结论:抗CⅡTA的M1-RNA(M1-3408-GS)降低了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。

抗CⅡTA核糖核酸酶P抑制Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类抗原的表达

探讨抗MHC-Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)的核糖核酸酶P对Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达的抑制作用.M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位.以pTK117质粒为模板,PCR扩增带有抗CⅡTA第452及629位点的引导序列的M1-RNA(M1-452-GS及M1-629-GS),再分别插入pUC19载体(pUC19-M1-452-GS和pUC19-M1-629-GS).从Raji细胞中克隆CⅡTA基因DNA片段(114～800)后插入pGEM-7zf(+)质粒.将重组M1-RNA与靶基因的mRNA进行细胞外共孵育,显示仅pUC19-M1-629-GS可特异性地切割靶基因mRNA.再将M1-629-GS克隆入psNAV载体(pA629)并稳定转染Daudi细胞株,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平,流式细胞术检测其HLA-DR、DP、DQ抗原表达.与对照组比较,M1-629-GS阳性Daudi细胞的CⅡTAmRNA含量减少90.19%(P<0·05),其HLA-DR、DP、DQ抗原表达分别降低91.97%、90.19%、92.36%(P<0·05).研究表明,抗CⅡTA的核糖核酸酶P可通过抑制CⅡTA的转录而降低Daudi细胞表面的MHC-Ⅱ类分子的表达.

CⅡTA核酶对肝细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制

目的:探讨抗CⅡTA核酶对肝细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制作用。方法:设计并克隆针对CⅡTA第134、218及464位点的核酶(分别为Rz134、Rz218、Rz464)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM-T载体,进行细胞外切割活性筛选。将切割作用明显的Rz464亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP(pIRES2-EGFP-Rz464,pRz464)进行细胞内切割分析。pRz464稳定转染人胎肝细胞,流式细胞术检测MHCⅡ(HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ)类抗原表达,RT-PCR分析CⅡTAmRNA水平。结果:pRz464肝细胞表面HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的诱导型表达分别为(1.01±0.51)%、(4.37±1.28)%和(1.98±0.42)%,与对照组比较分别下调90.65%、89.11%及65.32%;同时CⅡTA的诱导型mRNA含量明显减少(P<0.01)。结论:抗CⅡTA核酶-Rz464降低了CⅡTA的mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。

转染CⅡTA基因上调小鼠树突状细胞表面MHC分子和共刺激分子的表达

目的探讨MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC classⅡtransactivator,CⅡTA)基因对树突状细胞(Dendriticcell,DC)表面MHC-Ⅰ/-Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86的调节作用,为将树突状细胞应用于生物治疗奠定基础。方法从小鼠骨髓中大量扩增DC,用脂质体转染法将小鼠CⅡTA(mCⅡTA)基因转入DC中,用流式细胞术观察转染前、后DC表面MHCⅠ-/-Ⅱ类分子及CD80、CD86的表达。结果转染mCⅡTA基因使DC上MHC-Ⅰ/-Ⅱ分子的表达率由74.2%/66.7%明显上调为93.6%/91.4%;CD80/CD86的表达率由52.3%/60.5%明显上调为89.7%/91.5%(P<0.05)。结论转入mCⅡTA可使DC表面MHC-Ⅰ/-Ⅱ分子及CD80/CD86的表达率明显上调。本研究为将DC应用于肿瘤的生物治疗奠定了基础。

CⅡTA对MHCⅠ/Ⅱ类分子的反式激活作用

CⅡTA(MHCclassⅡtransactivator)指MHCⅡ类分子反式激活因子 ,与MHCⅠ /Ⅱ类基因及各种抗原递呈相关基因的表达密切相关 ,涉及的机理较为复杂。本文拟就CⅡTA对MHCⅠ

雷公藤内酯通过下调CⅡTA抑制BV-2小胶质细胞MHCⅡ表达

目的观察雷公藤内酯对海人酸活化的BV-2小胶质细胞MHCⅡ分子表达的影响,并探讨其相关的分子机制。方法将BV-2细胞随机分为对照组、海人酸组、雷公藤內酯组,免疫组化方法检测雷公藤内酯对海人酸活化的BV-2细胞MHCⅡ和CⅡTA蛋白的影响。结果对照组MHCⅡ阳性BV-2细胞为(0.059±0.005),海人酸组MHCⅡ阳性BV-2细胞为(0.893±0.038),经统计学处理二者存在显著性差异(P<0.05)。雷公藤内酯组MHCⅡ阳性BV-2细胞率(0.089±0.013),与海人酸组比较二者存在显著性差异(P<0.05);对照组CⅡTA阳性BV-2细胞为(0.043±0.003),海人酸组CⅡTA阳性BV-2细胞为(0.692±0.015),经统计学处理二者存在显著性差异(P<0.05)。雷公藤内酯组CⅡTA阳性BV-2细胞为(0.057±0.009),与海人酸组比较存在显著性差异(P<0.05)。结论雷公藤内酯可以抑制海人酸活化的BV-2细胞MHCⅡ表达,其机制可能与下调BV-2细胞CⅡTA表达有关。

MHCⅡ类分子反式激活因子(CⅡTA)的研究进展

MHCⅡ类分子反式激活蛋白 (CⅡTA ,classⅡtransactivator)的发现是近年来国际免疫学研究的一项重大突破 ,CⅡTA及其突变体在免疫调节和免疫治疗中具有诱人前景。本文对CⅡTA的结构、功能及其反式激活MHCⅡ类分子的机制作一综述 ,并对CⅡTA及其突变体的应用前景作一简要介绍。

小鼠pIV启动子调控CⅡTA突变体重组腺病毒表达选择性抑制MHC Ⅱ类分子的表达

目的:观察受CⅡTA-pIV启动子驱动的MHCⅡ类分子反式激活因子突变体(CⅡTAm)重组腺病毒对MHC Ⅱ类分子表达的选择性抑制作用,并探讨其相关机制。方法:构建了N-端酸性氨基酸区缺失了118aa的CⅡTA突变体及其CⅡ TA-pIV启动子驱动的重组腺病毒Ad-pIV-CⅡTAm,将Ad-pIV-CⅡTAm或对照腺病毒Ad-GFP感染小鼠内皮细胞株SVEC细胞和转染巨噬细胞株J774细胞,并以IFN-γ刺激。用RT-PCR检测野生型和突变型CⅡTA mRNA的表达,用流式细胞术检测MHC Ⅱ类分子在细胞表面的表达。结果:成功构建CⅡTA-pIV启动子调控下的CⅡTA突变体基因重组腺病毒表达载体Ad-pIV-CⅡ TAm;该腺病毒介导的CⅡTA突变体mRNA在SVEC和J774细胞内的表达受到IFN-γ的上调,同时抑制这些细胞上诱导型和组成型MHC Ⅱ类分子的表达。结论:Ad-pIV-CⅡTAm重组腺病毒是一种IFN-γ调控型表达载体,可有效地抑制受感染细胞上 MHC Ⅱ类分子的表达。

CⅡTA基因修饰树突状细胞增强荷肝癌小鼠抗瘤效应

目的:探讨MHC-Ⅱ类分子反式激活因子(MHCclassⅡtransactivator)CⅡTA基因对树突状细胞(Dendriticcell,DC)表面MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86的上调作用,为肝癌生物治疗提供新的思路。方法:从小鼠骨髓中大量扩增DC,并用脂质体转染法将小鼠CⅡTA(mCⅡTA)基因转入DC中,用流式细胞术观察转染前、后DC表面MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子及CD80、CD86的表达。建立小鼠肝癌模型,将荷肝癌小鼠分为4组,第1组:分别于肝癌组织块周围注入PBS;第2组:未转入mCⅡTA基因的DC;第3组:转入mCⅡTA基因的DC;第4组:转入mCⅡTA基因并经H22肿瘤抗原刺激的DC。每周1次,连续接种3wk,连续7wk动态测量肝癌的大小,观察转染mCⅡTA基因对荷肝癌小鼠抗瘤效应的影响。结果:转染mCⅡTA基因使DC上MHC-Ⅰ/Ⅱ分子的表达率由74.2%/66.7%明显上调为93.6%/91.4%;CD80/CD86的表达率由52.3%/60.5%明显上调为89.7%/91.5%(P<0.05)。免疫接种后,第4组荷肝癌小鼠肝癌组织块的平均面积明显小于第1、2、3组(在第3、4、5、6、7周时,与第1、2组相比较,P<0.05;在第5、6、7周时与第3组相比较,P<0.05)。结论:转入mCⅡTA后,DC表面MHC-Ⅰ/Ⅱ分子及CD80/CD86的表达率明显上调,DC的抗瘤效应增强。本研究为将DC应用于肿瘤的生物治疗提供了新的途径。

RNAi抑制大鼠骨髓源树突状细胞MHC-Ⅱ表达的研究

目的:应用RNAi技术探讨靶向主要组织相容性复合物Ⅱ类抗原反式转录激活因子(CⅡTA)的shRNA质粒载体抑制大鼠骨髓源树突状细胞(DC)表面MHC-Ⅱ类抗原表达的可行性。方法:体外培养大鼠骨髓源DC;流式细胞仪检测DC表面抗原MHC-Ⅱ、OX-62表达情况;体外合成针对CⅡTA mRNA序列特异性CⅡTA shRNA并构建质粒,在阳离子脂质体介导下转染DC;流式细胞仪检测细胞表面抗原MHC-Ⅱ表达水平的变化。结果:(1)经体外培养DC可用于后续反应,体外构建质粒成功;(2)流式细胞仪检测显示CⅡTA-shRNA质粒组中DC转染后MHC-Ⅱ的抗原水平均较对照组明显降低。结论:利用CⅡTA shRNA质粒载体沉默CⅡTA基因从而下调MHC-Ⅱ的表达的策略是可行的,为降低移植排斥反应提供了实验依据。

CⅡTA与自身免疫性甲状腺疾病

主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子反式激活因子(CⅡTA)是近年来发现的反式转录激活因子,对MHCⅡ类分子的表达起着严格且专一的调控作用,CⅡTA通过作用于多种MHCⅡ类转录激活因子、基础转录复合物及其他转录共激活因子,形成一个更加复杂的复合体来调控MHCⅡ类基因的表达。甲状腺细胞MHCⅡ类分子的异常表达与自身免疫性甲状腺疾病(AITD)密切相关。CⅡTA可诱导甲状腺细胞MHCⅡ类分子的异常表达。对CⅡTA基因结构和功能的研究将促进对MHCⅡ类分子表达调控机制及AITD发病机理的认识。

In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases

This study investigated the feasibility of using an hammerhead ribozyme against C Ⅱ TA, a major regulator of MHC Ⅱ antigens, to repress the expression of MHC Ⅱ molecules on Hela cells. A hammerhead ribozyme (Rz464) specific to 463-465 GUC triplet of C Ⅱ TA and its target gene were transcribed, then mixed up and incubated in vitro . The cleavage products were analyzed by PAGE and silver staining. Rz464 was then inserted into the pIRES2 EGFP vector (pRz464). Stable transfectants of Hela with pRz464 were tested for class Ⅱ MHC induction by recombinant human interferon gamma (IFN γ). mRNA of C Ⅱ TA was measured by RT PCR. Our results showed that Rz464 could exclusively cleave C Ⅱ TA RNA. When induced with IFN γ, the expression of HLA DR, DP, DQ on pRz464 + Hela was induced, and the mRNA content of C Ⅱ TA decreased too. It is concluded that Rz464 could inhibit C Ⅱ TA and thus the family of genes was regulated by C Ⅱ TA:MHC Ⅱ molecules. These results provided insight into the future application of Rz464 as a new nucleic acid drug against auto immune diseases.

腺病毒介导CIITA突变体基因转移抑制MHC II类分子表达的体外研究

目的:构建携带小鼠MHCII类分子反式激活因子(MHC class II molecule transactivator,CIITA)突变体基因的腺病毒,并观察腺病毒介导该基因的表达情况以及表达产物的体外功能。方法:采用常规分子生物学方法从IFN-γ诱导后的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中获得IV型CIITA cDNA;利用重叠延伸PCR法构建CIITA突变体基因,并克隆入表达载体pIRES;采用pAdEasy-1系统获得具有感染能力的、携带CIITA突变体基因的缺陷型重组腺病毒(Ad-CIITAm)和空载对照病毒(Ad-GFP),并经大量扩增、纯化及滴度测定;将Ad-CIITAm和Ad-GFP分别感染HeLa细胞和Raji细胞,流式细胞术观察对诱导型和组成型HLA-DR分子表达的影响。结果:成功克隆了小鼠CIITA突变体基因,并构建了携带小鼠CIITA突变体基因的重组腺病毒Ad-CIITAm;经流式细胞术证实感染Ad-CIITAm的Hela和Raji细胞较感染Ad-GFP的细胞,其表面HLA-DR分子的表达均受到明显的抑制。结论:本实验证实了重组腺病毒介导表达的小鼠CIITA突变体在体外能够有效地抑制MHCII类分子的表达。

主要组织相容性复合体Ⅱ类分子反式激活因子的研究进展

主要组织相容性复合体Ⅱ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ transactivator,CⅡTA)是 1993年发现的反式转录激活因子,被认为是MHCⅡ类分子表达的主要调控因子。本文就C Ⅱ TA的结构、功能以及对MHC基因调节及其应用前景作一综述。

CⅡTA反义cDNA抑制Hela细胞表面MHCⅡ类抗原的表达

目的 探讨Ⅱ类主要组织相容性复合物 (MHCⅡ )激活因子 (CⅡTA)的反义cDNA对细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制。方法 克隆 3条CⅡTA反义片段 (arⅡ 1、arⅡ 2、arⅡ 3) ,并稳定转染Hela细胞。免疫组化、流式细胞术检测细胞核内CⅡTA蛋白及其调控的经典MHCⅡ (HLA DR、 DP、 DQ)类抗原表达 ,RT PCR法检测CⅡTA、经典MHCⅡ及恒定链的mRNA水平。结果 三种反义片段中arⅡ 2效果最佳。在重组人IFN γ诱导下 ,arⅡ 2阳性Hela细胞与正义链组比较 ,CⅡTA蛋白抑制率达87.2 3% ,HLA DR、 DP及 DQ抗原诱导型表达分别降低了 79.2 1%、90 .31%及 4 8.30 % ;同时CⅡTA、经典的MHCⅡ及恒定链的mRNA含量明显减少 (P <0 .0 5 )。结论 CⅡTA反义片段抑制了自身mRNA含量 ,从而阻止其调控的MHCⅡ分子的表达 ,为预防移植物抗宿主病提供了一种新思路。

CⅡTA M1-RNA对MHCⅡ类分子表达的抑制作用

目的探讨MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)的M1-RNA对细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制。方法M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CⅡTA第452、629位点的M1-RNA(分别为M1-452-GS、M1-629-GS)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pUC19、pGEM-7zf (+)载体,进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作用明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体(psNAV-M1-629-GS,pA629)并稳定转染ECV304细胞株,流式细胞术检测经典的MHCⅡ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA的mRNA水平。结果pA629阳性ECV304细胞株与对照组比较,HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了89.21%及92.31%;同时CⅡTA的mRNA含量降低(P<0.05)。结论CⅡTA的M1-RNA(M1-629-GS)降低了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。

CⅡTA锤头状核酶抑制Jukart细胞MHCⅡ类抗原的表达

目的 针对同种异体细胞移植的免疫反应主要是由主要组织相容性复合物Ⅱ (majorhistocompatibilitycomplex ,MHC Ⅱ ,人类中亦称HLA Ⅱ )类抗原介导 ,而MHCⅡ类分子转录激活因子 (MHCclassⅡtransactivator ,CⅡTA)对MHCⅡ分子的表达起严格且专一性的调控作用 ,拟通过抗CⅡTA锤头状核酶 (ribozyme,Rz)抑制细胞表面MHCⅡ分子的表达。 方法 设计并合成针对人类CⅡTA基因第 134、2 18、4 6 4位点的一组核酶 ,分别命名为Rz134、Rz2 18、Rz4 6 4。通过体外制备和活性鉴定 ,筛选出活性较高的核酶———Rz4 6 4。将Rz4 6 4克隆到含有核糖体内进入位点及增强型绿色荧光蛋白的表达载体 (internalribosomeentrysite enhancedgreenfluorescentprotein ,pIRES2 EGFP) ,简称为 pRz4 6 4 ,并稳定转染Jukart细胞株 (pRz4 6 4 J) ,流式细胞术检测经典的MHCⅡ (HLA DR、DP、DQ)抗原表达 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测CⅡTAmRNA水平。结果 pRz4 6 4 J与无关核酶组比较 ,HLA DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了 73 2 7%、88 93%、5 8 82 % ;同时CⅡTA的诱导性mRNA含量明显减少 (P <0 0 1)。结论 抗CⅡTA锤头状核酶可抑制CⅡ ATmRNA的表达 ,从而阻止其调控的相应基因———MHCⅡ分子的表达 ,为进一步探讨免疫?