NK细胞与K562细胞之间相互免疫编辑作用及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的:探讨NK细胞与K562细胞混合培养前、后其杀伤活性的变化及分子机制。方法:流式细胞仪检测NK细胞与K562细胞混合培养前、后细胞表面相应分子的变化,LDH释放法测定效靶比20∶1时NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果:相互编辑前,K562细胞表面MICA/MICB的表达率为(79.90±0.87)%,NK细胞表面NKG2D、KIR2DL1和KIR3DL1的表达率分别为(98.27±0.67)%、(45.70±1.22)%和(35.60±1.35)%。相互编辑后,K562细胞表面MICA/MICB和NK细胞表面NKG2D的表达率分别为(35.56±1.01)和(34.67±3.88)%,均明显低于编辑前(P=0.000);NK细胞表面KIR2DL1和KIR3DL1的表达率分别为(47.20±1.08)%和(34.03±1.20)%,与编辑前比较差异均无显著性(P>0.05)。效靶比20∶1时,NK细胞对编辑后的K562细胞的杀伤活性为(24.07±0.58)%,编辑后的NK细胞对K562细胞的杀伤活性为(16.95±2.00)%,均明显低于编辑前NK细胞对K562细胞的杀伤活性[(54.03±3.46)%](P=0.000)。结论:NK细胞与K562细胞持续性接触后,双方发生了相互免疫编辑作用;NK细胞的杀伤活性下降,其分子机制是细胞表面相应的配受体发生了变化。

NK细胞免疫编辑后的人鼻咽癌细胞株CNE2 HLA I类分子和MICA/MICB的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的:探讨自然杀伤(NK)细胞与表达NKG2D配体的人鼻咽癌细胞株CNE2混合培养24h时CNE2细胞表面HLAI类分子及MHCI类链相关分子(MICA/MICB)的变化及编辑前、后的CNE2细胞对NK细胞杀伤敏感性的差异.方法:PCR-SSP法检测NK细胞KIR分型,流式细胞仪检测编辑前的CNE2细胞(单纯培养的CNE2细胞),编辑后的CNE2细胞(NK细胞与CNE2细胞10∶1混合培养24h)表面HLAI类分子及MHCI类链相关分子(MICA/MICB)的表达情况,LDH释放法测定3例健康者的NK细胞在不同效靶比时对编辑前、后的CNE2细胞的杀伤活性.结果:编辑前、后的CNE2细胞表面MICA/MICB的表达率分别为(88.67±2.81)%和(34.53±3.15)%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01);编辑前、后的CNE2细胞表面HLAI类分子表达率分别为(99.77±0.12)%和(97.80±0.87)%,两者相比差异无统计学意义(P>0.05).NK细胞对编辑前、后的CNE2细胞的杀伤活性在效靶比10∶1时分别为(26.96±1.47)%和(6.60±0.86)%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01);效靶比20∶1时分别为(35.74±3.59)%和(11.57±2.02)%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01).结论:CNE2细胞与NK细胞持续性接触24h,CNE2细胞表面HLAI类分子表达无改变,MI-CA/MICB表达下调,导致编辑后的CNE2细胞激发NK细胞杀伤活性下降.本研究初步证明了NK细胞对编辑后的肿瘤细胞杀伤活性下降的分子基础,同时为我们如何提高NK细胞的杀伤活性提供了新的干预的靶点.

MICA基因多态性与乳腺癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性

目的:探讨MHC-Ⅰ类链相关分子A(MHC class I chain-related molecule A,MICA)多态性与乳腺癌细胞对NK细胞杀伤敏感性的关系。方法:测序分析乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S和SK-BR-3的MICA等位基因,用Western blotting和流式细胞术检测MICA重组表达载体转染293T细胞(分别命名为p MCFA5.1、p MCFA4、p231A5R、p231A9和p435A5P)MICA蛋白的表达水平,用LDH法检测NK细胞对转染MICA的293T细胞的杀伤活性,酶联免疫斑点法检测NK细胞穿孔素、颗粒酶B分泌水平。结果:MCF-7细胞表达MICA*008/A5.1和MICA*001/A4,MDA-MB-231和SK-BR-3细胞均表达MICA*019/A5和MICA*002/A9,MDA-MB-435S细胞表达MICA*010/A5。转染MICA后,p MCFA5.1组293T细胞MICA蛋白的表达水平最低(P<0.05),p435A5P组次之(P<0.05),p MCFA4组、p231A5R组和p231A9组表达水平较高(均P<0.05)。NK细胞对转染MICA的293T细胞杀伤活性及穿孔素、颗粒酶B分泌:p435A5P组对NK细胞杀伤的敏感性最低(P<0.05),穿孔素、颗粒酶B分泌水平最低(均P<0.05);p MCFA5.1、p MCFA4、p231A5R和p231A9各组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MICA基因多态性与乳腺癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性密切相关。

两种基于恒定链活性片段载体在增强抗体分泌中作用的比较

目的:比较基于恒定链片段的两种载体的免疫效果和作用机理。方法:分别构建了含新城疫病毒抗原表位F306和Ii不同片段的三个嵌合体(Ii-key/F306、Ii-key/F306/ND(两个氨基酸残基)和用抗原表位取代Ii-CLIP的Ii/F306),经纯化后的融合蛋白免疫小鼠,并用ELISA检测其抗体效价。同时嵌合体与Mhc共转染COS7细胞,观察两者的细胞定位与结合。结果:Ii-key/F306免疫组比单独F306抗原肽免疫组的抗体效价提高2倍,Ii-key/F306/ND免疫组增至4倍,而Ii-F306免疫组只增强2.5倍。在与Mhc共转染的COS7细胞和免疫共沉淀中,Ii-key/F306和Ii-key/F306/ND既没有与MHCⅡ分子的膜共定位作用,也不能与后者结合;而Ii-F306却能与MHCⅡ分子在浆膜共定位,并与后者结合。结论:这些结果表明,嵌合体都具有增强免疫效果的作用,并提示Ii片段促进了抗原肽与MHCⅡ分子结合。

非小细胞肺癌患者的血清sMICA水平及临床意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中可溶性MHCⅠ类链相关分子A(sMICA)的水平及临床意义。方法采用酶联免疫吸附法检测本院2013年1月至2017年12月的65例初诊NSCLC患者和50例体检健康者以及40例化疗后可评价疗效NSCLC患者的血清sMICA水平,实时定量PCR检测12例手术或支气管镜活检肺癌组织和5例来源于肺大泡患者正常肺组织的MICA水平并分析组织MICA水平与血清sMICA水平的相关性,根据随访数据分析血清sMICA水平与预后的关系。结果NSCLC患者的血清sMICA水平为(127.2±25.7)ng/L,高于体检健康者的(57.2±26.7)ng/L(P<0.05)。25例Ⅰ~Ⅱ期患者的血清sMICA水平为(109.6±25.4)ng/L,低于40例Ⅲ~Ⅳ期患者的(136.2±23.6)ng/L(P<0.05);38例肺鳞癌患者的血清sMICA水平为(128.8±23.8)ng/L,与27例肺腺癌患者的(135.2±22.9)ng/L相比差异无统计学意义(P>0.05)。40例NSCLC患者通过化疗后,33例化疗有效者的血清sMICA水平为(72.5±29.7)ng/L,低于化疗前的(139.2±24.9)ng/L(P<0.05),而7例化疗无效者的血清sMICA水平为(153.2±35.2)ng/L,较化疗前(131.2±16.7)ng/L的差异无统计学意义(P>0.05)。NSCLC患者的血清sMICA水平与肺癌组织的MICA水平无关(r=0.131,P=0.685)。血清sMICA低水平组的中位总生存期为1185天,优于高水平组的984天(P<0.05)。结论NSCLC患者的血清sMICA水平升高且与患者的治疗反应和预后有关,但与肺癌组织的基因表达无关。监测患者外周血清中sMICA水平有助于NSCLC临床诊断和疗效评估。

白介素-28A增加顺铂对卵巢癌细胞毒性的作用及机制研究

目的探讨白介素-28A(IL-28A)增强顺铂对卵巢癌的细胞毒性作用及其机制。方法实时荧光定量PCR法检测卵巢癌组织和细胞及正常卵巢上皮组织和细胞中IL-28A水平。IL-28A(100ng/ml)预处理C13K细胞24h,CCK-8和流式细胞术分别检测顺铂对C13K细胞半数抑制浓度(IC50)、细胞存活率和细胞凋亡率。免疫磁珠法从健康志愿者外周静脉血中分选NK细胞,流式细胞术检测NK细胞纯度,LDH释放法检测NK细胞对C13K细胞杀伤活力。酶联免疫吸附法分析上清液中IL-28A水平。Q-PCR、Western blot及免疫荧光分别检测IL-28A和其受体IL-10R2及MHC-I类链相关分子A(MICA)mRNA及蛋白水平表达。结果卵巢癌组织和细胞中IL-28A mRNA表达显著低于卵巢正常上皮组织及细胞(P<0.01)。分选NK细胞纯度达80%以上,IL-28A预处理后顺铂对C13K细胞IC50下降明显,细胞增殖抑制,细胞凋亡率达(20.98±2.3)%,NK细胞对C13K细胞杀伤力增加(P<0.01)。随着细胞中IL-28A及其受体IL-10R2 mRNA及蛋白水平表达增加,细胞中MICA mRNA与蛋白水平表达亦明显上升,上清液中IL-28A水平提高,与阴性对照及PBS组比较差异显著(P<0.01)。结论IL-28A可协同增加顺铂对C13K的细胞毒性,其机制与IL-28A抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,促进C13K细胞MICA表达,增强NK细胞对C13K细胞杀伤有关。

用优化的OE-PCR法构建CⅡTA中间缺失突变体

目的：以构建缺失第109～226位氨基酸密码子的MHCII类分子反式激活因子（MHCclass Ⅱ molecule transactivator，CIITA）突变体为例探索一种简便、稳定的构建中间缺失突变体的方法。方法：首先按照传统重叠延伸PCR方法的原理扩增缺失片段两端的基因片段，再将两片段混合，在不加入外围引物的情况下进行8次PCR循环以有效完成重叠延伸，然后再加入引物进行目的片段指数扩增，将扩增产物直接克隆至真核表达载体pIRES。结果：成功地构建出缺失第109～226位氨基酸密码子的CⅡTA突变体。结论：优化后的重叠延伸PCR法（OE—PCR）克服了传统方法的诸多弊端，非常适合于构建中间缺失突变体，值得推广。

蛋白酶体抑制剂Bortezomib对NK细胞杀伤肝癌细胞活性的影响

目的探讨小剂量蛋白酶体抑制剂Bortezom ib对肝癌细胞MHCⅠ类分子(M ICA)的表达及NK细胞杀伤活性的影响。方法应用流式细胞仪和半定量RT-PCR检测肝癌细胞经小剂量蛋白酶体抑制剂Bortezom ib处理后M ICA表达水平。应用细胞毒实验和胞内染色检测NK细胞功能。结果肝癌细胞株或新鲜肝癌细胞经小剂量蛋白酶体抑制剂Bortezom ib处理后M ICA表达增加,进而促进经NKG2D途径介导的NK细胞杀伤活性。结论联合小剂量蛋白酶体抑制剂Bortezom ib和NK细胞为基础的免疫治疗有助于提高原发性肝细胞癌的综合治疗效果。

非小细胞肺癌血清sMICA、microRNA-99a、DJ-1表达及临床意义

目的 分析血清可溶性MHCⅠ类链相关分子A(sMICA)、microRNA-99a、DJ-1蛋白(DJ-1)对非小细胞肺癌(NSCLC)诊断及预后评估价值。方法 收集2019年6月至2022年6月本院收治的NSCLC患者90例(NSCLC组),另选取本院同期健康体检志愿者90例(对照组)。对患者进行为期6个月随访,随访截止至2023年1月。采用ROC曲线评估sMICA、microRNA-99a、DJ-1对NSCLC诊断价值。采用多元Logistic回归分析影响NSCLC患者预后的关系。结果 NSCLC组sMIC、DJ-1表达水平高于对照组,microRNA-99a表达水平低于对照组(P<0.05);ROC曲线结果显示:sMICA、microRNA-99a、DJ-1对NSCLC诊断AUC值分别为0.742(95%CI:0.642~0.842)、0.759(95%CI:0.660~0.859)、0.789(95%CI:0.698~0.901)。90例患者中预后良好69例,预后不良21例。预后不良者sMIC、DJ-1表达水平高于预后良好组,microRNA-99a表达水平低于预后良好组(P<0.05);预后不良者TNM分期(III-IV期)、低分化占比高于预后良好组(P<0.05);两组在年龄、性别、肿瘤直径、病理类型中比较差异无统计学意义(P>0.05)。经多元Logistic回归分析:临床分期、分化程度、sMICA、microRNA-99a、DJ-1为影响NSCLC患者预后不良的危险因素(P<0.05)。结论 相对健康人群,NSCLC患者sMICA、DJ-1水平高,microRNA-99a水平低;三指标水平与患者预后密切相关,通过检测血清三者水平可为患者后续诊疗、预后评估提供参考资料。

EGFR靶向抗体融合蛋白激活免疫细胞杀伤肝癌细胞Huh7的研究

目的探究靶向表皮生长因子受体(EGFR)的抗体西妥昔单抗(Cetuximab)与MHC-I(major histocompatibility complex-I)相关抗原分子MICB(MHC class I-related chain molecules B)的融合蛋白对肝癌细胞Huh7的杀伤效果。方法通过重叠PCR(polymerase chain reaction)的方法通过柔性肽G4S将西妥昔单抗重链C末端及人MICB胞外区基因连接,构建成工程载体,并通过毕赤酵母进行表达;流式检测融合蛋白对Huh7细胞的结合能力;噻唑蓝(MTT)法检测Huh7细胞的增殖抑制;通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实验验证融合蛋白是否能激活NK细胞杀伤肿瘤细胞。结果通过基因工程手段和毕赤酵母表达,成功获得融合抗体蛋白,经Western blot鉴定结果说明融合蛋白Cetuximab-MICB表达及装配正确。流式细胞术检测Cetuximab-MICB与肝癌细胞Huh7的结合率为72.8%,与母体西妥昔单抗结合率(75.5%)相当。细胞增殖抑制实验,与PBS组对照相比,西妥昔单抗、融合蛋白组对肝癌细胞Huh7均有抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性。在蛋白浓度为400 nmol/L时,Cetuximab-MICB融合蛋白组抑制率(66.09%)强于西妥昔单抗组(56.54%)。将免疫细胞PBMC(peripheral blood mononuclear cell)/NK92和肿瘤细胞Huh7共孵育,通过检测LDH(lactate dehydrogenase)的释放,发现融合蛋白比西妥昔单抗更有效地介导NK细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤,以PBMC为效应细胞,效靶比为100:1时Huh7细胞裂解率可以达到43.58%,优于西妥昔单抗组(37.77%)。以NK92细胞为效应细胞,效靶比为10:1时Huh7细胞裂解率可以达到61.29%,明显优于西妥昔单抗组(40.54%)。结论采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了Cetuximab-MICB融合蛋白。Cetuximab-MICB融合蛋白具有良好的体外抗肿瘤活性,有效的抑制肿瘤细胞Huh7的增值,并能进一步通过NKG2D途径激活NK细胞加强免疫系统对肿瘤的免疫监视,为抗肿瘤治疗提供了新的思路,有潜在的临床应用前景。

系统性红斑狼疮患者外周血单核细胞MⅠCs分子异常表达及其机制

目的:了解系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单核细胞主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类链相关分子(MⅠCs)、IL-15表达水平变化及其潜在机制。方法:收集20例SLE患者及20例健康志愿者外周血,分离单核细胞及血清,采用流式细胞术检测单核细胞表面MⅠCs及mIL-15的表达,EILIS法检测血清中干扰素-γ(INF-γ)、干扰素-α(INF-α)浓度,并对单核细胞表面MⅠCs表达水平与血清INF-γ浓度作相关性分析。进一步以SLE患者血清与健康志愿者单核细胞体外孵育,在有或无抗INF-γR存在的情况下,检测单核细胞表面MⅠCs分子的表达情况。结果:SLE患者血清IFN-γ浓度与健康对照组相比有显著性差异,其中IFN-γ在SLE患者为(429.7±145.0)pg/ml[健康对照为(73.8±18.9)pg/ml],二者有显著性差异(P<0.01);单核细胞MⅠCs及mIL-15的阳性率分别为(37.0±18.1)%和(36.0±7.3)%,而健康志愿者单核细胞MⅠCs及mIL-15的阳性率为(7.2±2.4)%和(7.6±2.5)%。SLE患者MⅠCs及mIL-15阳性率显著高于健康志愿者(P<0.01);SLE患者单核细胞MⅠCs分子表达水平与血清INF-γ浓度呈正相关;SLE患者血清中高浓度的IFN-γ可以刺激正常人单核细胞表达高水平的MⅠCs及mIL-15。结论:SLE患者血清INF-γ浓度异常升高,导致外周血单核细胞表面MⅠCs及IL-15异常高表达。