乙型肝炎病毒全基因转染L02细胞模型的建立及其HLA-A,B,C和MHCⅠ类链相关基因A／B分子的表达

目的 以双拷贝HBV全基因质粒pEcob6转染非癌性肝源细胞株L02细胞建立有HBV分泌的细胞转染模型,通过检测细胞表面HLA-A,B,C及MHC Ⅰ类链相关基因（MIC）A／B分子,分析HBV对肝细胞HLA-A,B,C和MICA／B表达的影响。方法 用EcoRⅠ酶切掉pEcob6的HBV基因并连接,构建无HBV基因的对照空质粒;用脂质体法以pEcob6或空质粒与pcDNA3．1-neo-共转染L02细胞株,筛选抗性细胞株并稳定传代;用Abbott EIA试剂和免疫荧光法检测细胞上清液和（或）细胞的HBsAg、HBcAg和HBeAg表达,实时荧光定量PCR检测HBV DNA含量;用流式细胞仪检测细胞表面HLA-A,B,C和MICA／B分子的表达,分析两种分子表达的变化。结果 经G418抗性克隆筛选,pEcob6稳定转染细胞株（L02-HBV）的上清液HBsAg和HBeAg可达24．78 （S／N）和4．117（S／N）,HBV DNA为9．67×10^4拷贝／ml;而对照空质粒转染细胞株（L02 mock）和L02的表达均为阴性。共聚焦显微镜观察,L02-HBV细胞内的HBsAg强表达于细胞质内,而HBcAg弱表达于胞核或胞质内。流式细胞检测结果显示,L02和L02-mock细胞有HLA-A,B, C的表达,基本无MICA／B的表达,L02-HBV细胞HLA-A,B,C和MICA／B的表达均增强,差歼有统计学意义（P〈0．05）。结论 以HBV全基因质粒转染L02细胞经筛选、克隆、传代,可获得有HBV相关抗原表达及HBV DNA分泌的细胞模型。HBV基因的转录或复制可增强肝细胞株L02的HLA-A-A,B,C及MICA／B的表达,可能与肝细胞的免疫损伤有关。

采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体

目的采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞（CTL）表位MHC单链三聚体，为增强HBV特异性免疫提供新方法。方法构建小鼠MHCⅠ类分子（H-2L^d）限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链（Ld）和β2M链（β2-microglobulin，β2微球蛋白）的单链三聚体（HBsAg—SCT）。并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体，以HBsAg和OVA—SCT作为对照，转染293A细胞，包装产生携带HBsAg—SCT，HBsAg和OVA—SCT的重组腺病毒。结果经双酶切和克隆测序鉴定，HBsAg—SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体，通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白。通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg—SCT能与抗-Flag抗体发生反应。结论编码HBsAg—SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建，并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒。

中国南方汉族人群MICA-STR的遗传多态性

目的人类MICA(MHCclassⅠchainrelatedgeneA)基因位于HLAⅠ类区HLAB近着丝粒端46kb。MICA遗传多态性与器官移植、多种疾病的遗传易感性有密切关系。本工作研究中国南方汉族正常人群MICA基因第5外显子微卫星(MICASTR)遗传多态性。方法采用荧光PCR/sizesequencing和PCR/SSP技术分析231例中国南方汉族健康个体MICASTR等位基因及MICA缺失型(MICADel)频率。结果在该群体中发现MICAA4、MICAA5、MICAA5.1、MICAA6、MICAA9、MICADel,其中以MICAA5、MICAA5.1最为常见,频率分别为0.362、0.313;共检出MICADel携带者3例,MICADel基因频率为0.006,该3例样本经PCR/SSP定型,均为HLAB48阳性。MICASTR基因型分布符合HardyWeinberg平衡。结论中国南方汉族人群MICASTR等位基因的构成不同于其他人群;此外,该人群存在低频率的MICA基因缺失。