MHC-Ⅱ联合MHC-Ⅰ免疫组化染色在特发性炎性肌病诊断中的应用价值探讨

目的探讨主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ联合MHC-Ⅰ免疫组化染色在特发性炎性肌病(IIM)诊断中的应用价值。方法收集2010年3月至2018年4月在首都医科大学宣武医院神经内科行肌肉活检患者的标本29份,并通过医院电子病历系统收集患者的临床资料,包括4种IIM[皮肌炎(DM)5例,多发性肌炎(PM)5例,散发性包涵体肌炎(IBM)4例及坏死性自身免疫性肌病(NAM)5例]和2种非炎性肌病(NIM)[肌营养不良(MD)5例,dysferlinopathy肌病5例]。将标本进行苏木精-伊红(HE)染色及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ免疫组化染色。结果免疫组化染色结果显示,PM、DM及IBM患者肌肉标本MHC-Ⅰ阳性率达100.0%,NAM和MD患者肌肉标本MHC-Ⅰ阳性率为80.0%,dysferlinopathy肌病患者肌肉标本MHC-Ⅰ阳性率为20.0%。PM和IBM患者肌肉标本MHC-Ⅱ阳性率分别为40.0%、50.0%,其余类型疾病患者肌肉标本的MHC-Ⅱ免疫组化染色均呈阴性。结论相较于MHC-Ⅰ免疫组化染色,MHC-Ⅱ免疫组化染色在鉴别IIM与NIM中有较高的特异性。MHC-Ⅱ联合MHC-Ⅰ免疫组化染色对不同肌病类型的诊断有较好的临床应用价值。

syk真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MHC-Ⅰ类分子表达的影响

目的:构建非受体蛋白酪氨酸激酶Syk的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞,使其在细胞中稳定表达,以研究Syk对人乳腺癌细胞MHC-Ⅰ类分子表达的影响。方法:以RT-PCR法从人乳腺癌细胞株MDA-MB-468扩增出syk编码序列基因片段,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO中。对重组质粒进行酶切、PCR及测序鉴定后,以脂质体介导法转染Syk缺失的人乳腺癌细胞MDA-MB-231,经G418筛选,构建syk基因稳定表达的细胞株,通过Western blot、RT-PCR和流式细胞术检测转染乳腺癌细胞Syk、MHC-Ⅰ及ICAM-Ⅰ的表达。结果:构建了hsyk真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/hsyk,并在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中获得稳定表达。表达Syk的MDA-MB-231细胞同时可以高表达MHC-Ⅰ和ICAM-Ⅰ。结论:成功地构建了syk真核表达载体并在真核细胞中表达,为进一步的肿瘤免疫研究奠定了实验基础。

HIV-1 Nef下调MHC—Ⅰ分子研究进展

HIV-1感染机体后，HIV-1 Nef可以下调患者体内受染CD4^＋细胞表面MHC—Ⅰ分子，同时使受染细胞表面HIV-1抗原暴露水平降低，从而引起CILs识别该类受染细胞能力下降。这使得体内HIV-1躲避CTLs免疫应答和形成人体长期的慢性感染。Nef的这种功能与人体内HIV-1长期潜伏性有重要关系，对其深入研究可能为艾滋病治疗带来新的理论依据。此文就此进行相关综述。

MHC-Ⅰ荧光四聚体载体的构建及其真核表达

目的构建MHC-Ⅰ荧光四聚体真核表达质粒,并表达、纯化该蛋白,以更简便地检测特异性T细胞。方法运用分子克隆技术,构建sKb-ZsGreen-6× His标签的融合蛋白真核表达质粒,转染293FT细胞表达,并以镍亲和层析法纯化。结果经酶切及测序鉴定证实成功构建了MHC-Ⅰ荧光四聚体真核表达质粒并完成表达、纯化,并经SDS-PAGE电泳证实。结论得到了纯化的MHC-Ⅰ荧光四聚体,并经流式细胞术证实其与β2-微球蛋白、OVA肽结合后能被B3Z细胞识别,为特异性T细胞检测提供了一种更方便的方法。

健脾解毒方延长脾虚肝癌大鼠带瘤生存与MHCⅠ/MHCⅡ的关系

目的:探讨健脾解毒方延长脾虚肝癌模型大鼠带瘤生存及与MHCⅠ/MHCⅡ的关系。方法:105只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、肝癌模型组、脾虚模型组、脾虚肝癌模型组、胸腺五肽组及健脾解毒方低、高剂量组,进行造模和干预。实验中记录动物的体质量、生存时间、肝癌大鼠濒死状态时恶液质积分并采集标本。免疫组化与Western blot方法检测大鼠肝组织及肝癌组织MHCⅠ/MHCⅡ分子表达。结果:健脾解毒方高剂量组和胸腺五肽组累积生存率高于其余各组(P<0.05),且其恶液质评分低于其余各组(P<0.05)。各造模组中,MHCⅠ分子在肝组织中的表达水平高于癌组织,肝组织和癌组织中均以健脾解毒方高剂量组表达最强(P<0.01)。MHCⅡ分子在癌组织表达强于肝组织,肝组织中以健脾解毒方高剂量组表达最强(P<0.01),癌组织中以脾虚肝癌组表达最强(P<0.01)。结论:健脾解毒方能对抗移植瘤导致的恶液质的发生和进展,显著延长荷瘤鼠的生存时间,其作用可能与上调MHCⅠ/MHCⅡ有关。

五龙鹅MHC ClassⅠ基因克隆及同源建模研究

主要组织相容性复合体（MHC）与动物机体对外源性抗原的免疫应答之间存在关联。从GenBank/DDBJ/EMBL基因库中读取鸡、其他鸟类、爬行类和哺乳类的MHC ClassⅠ基因进行序列分析设计引物，使用LA—PCR法从五龙鹅的基因组中克隆了MHC ClassⅠ基因序列（DNA序列和mRNA序列GenBank登录号分别为：AM114925和AM114924），并分析其基因组结构。运用生物信息学技术对测序结果进行分析显示：基因组DNA由8个外显子和7个内含子组成，与鸡基因序列同源率为60．8％～64．1％，与人的同源率为42．9％。分子进化树进一步揭示了五龙鹅与鸡、其他鸟类、爬行类、哺乳类以及人类的进化关系，同源建模分析发现该基因由氨基末端结构域和羧基末端结构域构成。

猪MHC-Ⅰ α生物素化序列融合基因的构建、表达与纯化

采用RT-PCR技术从猪外周血单核细胞(PBMC)中获得猪白细胞抗原基因座P1、P14等位基因的胞外区,并在其3′端拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP),构建了pET-P1-BSP和pET-P14-BSP高效表达载体并进行诱导表达和纯化,用SDS-PAGE和Western blotting法对表达产物进行鉴定。结果显示,成功构建了融合表达载体pET-P1-BSP和pET-P14-BSP,表达产物以包涵体的形式存在,获得高纯度的P1-BSP和P14-BSP蛋白,为进一步利用亲和素在体外构建SLA-I类分子肽四聚体奠定了基础。

异基因MHCⅠ修饰对骨髓细胞的免疫学特性的影响

目的 :观察异基因MHCⅠ修饰对骨髓细胞的免疫学特性的影响 ,探讨MHCⅠ类分子在诱导免疫耐受中的作用机制。方法 :由逆转录病毒载体pMSCV介导 ,将BALB C小鼠的MHCⅠ类分子H 2Dd 基因导入C5 7BL 6小鼠的骨髓细胞 ,流式细胞仪检测转染后基因的表达。MTT法检测混合淋巴细胞反应 ,乳酸脱氢酶释放法测定BALB C小鼠NK细胞对H 2Dd 修饰后C5 7BL 6小鼠骨髓细胞的杀伤活性。结果 :重组逆转录病毒感染的C5 7BL 6小鼠骨髓细胞对BALB C小鼠脾细胞的刺激强度或应答程度 ,与未转染和空载体病毒感染的C5 7BL 6小鼠骨髓细胞相比都显著减弱。BALB C小鼠NK细胞对转染H 2Dd 基因后的C5 7BL 6小鼠骨髓细胞的杀伤显著降低。结论 :在骨髓移植中用受者MHCⅠ分子修饰供者骨髓细胞可能诱导免疫耐受。

穿膜序列对MHC-Ⅰ类限制性CTL表位呈递影响的研究

目的 :从时间依赖性抗原呈递动力学的角度研究穿膜序列 (CPP)对 MHC- 类限制性 CTL 表位呈递的影响。 方法 :应用多肽固相合成技术 ,分别合成含 CPP与 H- 2 Kb限制性 CTL 表位 OVA2 57- 2 6 4的融合多肽 ,同时合成该表位 N、C端自然延伸的抗原肽和无关对照肽。采用流式细胞仪 (FACS)分析技术 ,检测抗原呈递细胞 (APC)在不同时相点对上述各抗原肽进行 MHC- 类呈递的情况。结果 :与不含 CPP的抗原肽相比 ,含 CPP的抗原肽中的 CTL 表位更易进入 APC内 MHC- 类呈递途径 ,表现为呈递所需时间明显缩短 (P<0 .0 5 ) ,且同一时相点的呈递强度显著增加 (P<0 .0 5 )。 结论 :在外源性抗原肽中引入穿膜序列可明显促进其 MHC- 类限制性 CTL 表位的呈递效率 。

CPP Tat_(49-57)促进外源CTL表位进入MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的机制研究

目的研究穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)促进外源CTL表位进入抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的效应及呈递机制。方法应用多肽固相合成技术,将源于HIV-Tat的穿膜序列Tat49-57连接在H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的氨基端形成融合肽即Tat49-57-CTL257-264,同时合成该表位和氨基端自然延伸的对照肽NH2 extended-OVA257-264。采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测APC对各肽的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学,并进行MHC-Ⅰ类抗原呈递阻断和TAP依赖性实验。结果在所测时间点,APC对于Tat49-57-CTL257-264的呈递强度均明显高于NH2 extended-OVA257-264;氨基肽酶抑制剂Bestatin可部分抑制APC对于Tat49-57-CTL257-264的MHC-Ⅰ类抗原呈递,而蛋白酶体抑制剂Lactacystin则无抑制效应;Tat49-57-OVA257-264可被TAP缺陷细胞RMA-S内MHC-Ⅰ类分子有效呈递,其呈递强度远超过RMA-S细胞对NH2extended-OVA257-264的呈递。此外,RMAS固定后则丧失对Tat49-57-OVA257-264和NH2 extended-OVA257-264的MHC-Ⅰ类限制性呈递能力,但其表面的“空”MHC-Ⅰ类分子仍可呈递单纯表位肽OVA257-264。结论CPP Tat49-57可有效促进与之融合的CTL表位肽被细胞内MHC-Ⅰ类分子提呈,表现为动力学显著增强,且该过程表现为蛋白酶体/TAP非依赖、氨基肽酶依赖。

肝癌细胞CD80表达与MHC-Ⅰ分子的关系

目的：研究共刺激分子CD80在肝癌细胞中的表达与MHC－I（Majorhistocompatibilitycomplex）分子相互关系，以探讨在肿瘤细胞所诱发的免疫排斥反应中共刺激分子对抗原提呈机制的影响。方法：通过逆转录病毒载体介导，将CD80基因转入肝癌细胞系HHCC，以流式细胞仪检测其表面MHC－I分子的表达情况。同时检测LAK细胞对转染前后的细胞的杀伤效果。结果：表达CD80的肝癌细胞其表面MHC－I分子表达明显增高（P＜0.01），而γ－INF刺激对细胞表面MHG-I分子的表达情况并无影响（P＞0.05）。LAK细胞对转染后细胞的杀伤作用远远大于未转染组（P＜0．01），而γ-INF刺激前后的细胞毒活性几乎无改变（P＞0．05）。结论：转染CD80后肝癌细胞高表达MHC-I分子，增强抗原提呈作用的同时又表达第二信号—共刺激分子CD80，从而可诱发更强的免疫排斥反应。

淮南麻黄鸡MHCⅠα链基因的克隆及序列分析

典型的主要组织相容性复合体（MHC）是抗原递呈的关键分子,具有重要的免疫功能,与多种疾病密切相关。为深入了解地方品种鸡MHCⅠ类α分子的特征,尤其是抗原结合区域的特点,通过RT-PCR技术获得了29个淮南麻黄鸡完整的α链基因,并进行了分析。结果显示,淮南麻黄鸡MHCⅠα分子高度多态,但主要集中在α1和α2区域,该区变异氨基酸位点共68个,其中高度变异22个。淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域氨基酸序列同源性介于79.3%-99.5%之间,仅少部分序列完全一致。鸡氨基酸序列同源性与鸭较高,介于57.6%-64.1%之间;其次为人和鼠。进化分析显示,淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域分属于两个类群,但未显示明显的品种差异。此外,鸡与鸭的亲缘关系较近,与其他物种则遗传距离较远。研究结果表明,淮南麻黄鸡MHC分子在进化过程中呈现高度的多态性,但受到病原体的选择压力,多态性主要位于抗原肽结合部分的α1和α2区域。

ER滞留信号肽对外源CTL表位进入胞内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的促进作用

目的探讨哺乳动物内质网(endoplasmic reticulum,ER)滞留信号肽(retrieval signal sequence)能否促进外源CTL表位肽进入抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径。方法应用多肽固相合成技术将哺乳动物内质网滞留信号——赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Lys-Asp-Glu-Leu,KDEL)基序融合在H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的羧基端,同时合成该表位和氨基端自然延伸四个氨基酸(TEWT)的对照肽OVA257-268。选择巨噬细胞系Ana-1作为本研究的APC,采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测各抗原肽在Ana-1内的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学。结果羧基端KDEL基序可明显增强与之偶联的CTL表位在APC内的MHC-Ⅰ类抗原呈递效率,并且显著延长APC表面MHC/肽复合物的呈递时间。结论羧基端KDEL基序修饰是将外源肽有效导入APC内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的一个简单有效的新策略,可为肿瘤治疗性肽疫苗的分子设计与研究提供新思路和实验依据。

畜禽MHCⅠ分子抗原结合槽研究进展

主要组织相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complex,MHCⅠ)结构的解析可直观地阐释其结合抗原表位的机理,进而有效利用其特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答。目前已报道的畜禽MHCⅠ精细结构包括牛(N*01301、N*01801)、猪(SLA-1*0401)和鸡(BF2*2101、BF2*0401、BF2*0201、BF2*1401),以上MHCⅠ复合体结构由α1、α2和α3共3个α链和β2m组成。其抗原结合槽多肽由A、B、C、D、E、F 6个口袋组成,一般B、F口袋决定了不同MHCⅠ分子结合不同性质的抗原多肽。鉴于同一物种不同的MHCⅠ等位基因及不同物种MHCⅠ基因的序列差异性,使得不同的MHCⅠ分子结合不同性质的抗原多肽片段,此外,不同MHCⅠ分子也可递呈同样的抗原多肽,实现不同MHCⅠ分子的交叉递呈。畜禽MHCⅠ的结构清晰地阐释其递呈抗原多肽的机理,促进了畜禽免疫学和疫苗应用的研究。

鸡MHCⅠα和β2m的原核表达与多克隆抗体的制备

为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。

携带非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A穿膜区等位基因中晚期食管癌患者对NK细胞免疫治疗的敏感性高

目的:探讨非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A(MHC classⅠ-related molecules A,MICA)穿膜区等位基因对中晚期食管癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗疗效的影响。方法:选取福建省肿瘤医院2013年4月至2015年10月收治的中晚期(TNMⅢ-Ⅳa期)食管癌患者152例,均在姑息性手术后行全身化疗,根据患者MICA穿膜区等位基因是否为A5.1分为4组:(1)A5.1化疗+NK细胞治疗(A5.1+NK)组;(2)A5.1单纯化疗(A5.1)组;(3)非A5.1化疗+NK细胞治疗(no A5.1+NK)组;(4)非A5.1单纯化疗(no A5.1)组,观察各组患者临床疗效。构建食管癌组织标本MICA等位基因A5.1的真核表达载体p TE-1A5.1,转染食管癌TE-1细胞株;Western blotting检测p TE-1A5.1转染对TE-1细胞MICA蛋白表达的影响,LDH法检测TE-1细胞转染p TE-1A5.1前后对NK细胞杀伤敏感性的变化,ELISA法检测食管癌患者血清可溶性MICA及转染p TE-1A5.1前后TE-1细胞上清中可溶性MICA含量。结果:经过3年的随防,A5.1+NK组患者中位总生存期(medium overall survival,m OS)为15.0个月,A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组为22.4个月,no A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.05)。经Cox多因素回归分析发现,患者年龄、性别、ECOG评分及基因型与预后均无明显相关(P>0.05),将基因类型与是否NK细胞治疗进行交叉分析,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.01)。转染p TE-1A5.1后TE-1细胞内MICA表达显著升高,培养液上清可溶性MICA分泌明显增加[(256.2±45.3)vs(45.3±11.5)pg/ml,P<0.01];与转染前相比,NK细胞对过表达MICA的TE-1细胞的杀伤率明显降低[(29.5±7.2)%vs(42.5±7.1)%,P<0.05]。结论:相对中晚期食管癌MICA穿膜区A5.1等位基因患者,非A5.1基因患者手术后化疗联合NK细胞的疗效较好,其机制与其不容易产生可溶性MICA密切相关。

卵巢癌细胞MHC-Ⅰ类抗原表达与肿瘤微环境免疫细胞分布关系

目的 探讨卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达与肿瘤微环境免疫活性细胞分布的关系 ,了解机体肿瘤微环境免疫功能状态。方法 用流式细胞仪检测卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达 ,同时用免疫组化方法检测肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布情况。结果 卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达存在不同程度的下降或缺如 ,且与肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布呈正相关 ,前者r=0 .846 ,P =0 .0 0 0 1,后者r =0 .738,P =0 .0 0 0 1。结论 上皮性卵巢癌细胞MHC Ⅰ类抗原分子的表达影响肿瘤微环境中浸润免疫细胞数 ,进而影响肿瘤微环境免疫监视能力。检测MHC Ⅰ类分子表达可为肿瘤浸润淋巴细胞临床过继治疗选择合适病例提供实验依据。

湖南地区白血病MHC-Ⅰ类链相关基因A微卫星多态性分析

目的:探讨MHC-Ⅰ类相关链基因A(MHC class-Ⅰchain related gene A,MICA)与湖南地区白血病之间的相关性。方法:应用荧光聚合酶链反应-基因扫描技术和聚合酶链反应-序列特异性引物技术分析,对62例白血病患者和112名正常人群进行MICA基因第5外显子微卫星等位基因分型及MICA基因缺失检测。结果:慢性粒细胞白血病组(n=35)的MICA*A5基因频率显著低于正常对照组(RR=0.635,P=0.0380);急性淋巴细胞性白血病组(n=13)的MICA*A4基因频率显著低于正常对照组(RR=0.120,P=0.0297);而在急性非淋巴细胞性白血病组(n=14),MICA*A5基因频率显著高于正常对照组(RR=2.229,P=0.0218)。结论:本文数据显示,MICA-STR多态性与湖南地区白血病之间存在相关性;不同病理类型的白血病相关格局有所不同。

MHC-Ⅰ类抗原加工途径异常与肿瘤关系的研究进展

随着免疫学研究的不断深入,MHC鄄Ⅰ类抗原呈递细节已逐渐明晰,全面认识肿瘤细胞MHC鄄Ⅰ类相关抗原加工途径缺陷或改变与肿瘤生物学及肿瘤临床的关系,将有助于肿瘤的诊治和预防。