中国人群MHC—Ⅱ类抗原DR4基因体外扩增定型分析及其与类风湿关节炎相关性的研究

本工作拟建立一种 HLA 基因组 DNA 定型方法,采用聚合酶链反应技术对所要分析的 HLA—Ⅱ DR4基因进行体外扩增,并配合等位基因特异性寡核苷酸探针对扩增产物进行分析,以确定个体是否带有该型等位基因.我们用该方法对上海地区52例正常人及32例类风湿关节炎病人 DR4基因进行了分析,结果显示正常人 DR4基因携带者为17.3%,而类风湿关节炎病人高达43.8%(RR=3.7,P<0.01),DR4阳性的病人多为重症活动者(X^2=11.7,P<0.005).此外,我们将该方法与血清学定型方法进行了比较.

MHC-Ⅱ联合MHC-Ⅰ免疫组化染色在特发性炎性肌病诊断中的应用价值探讨

目的探讨主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ联合MHC-Ⅰ免疫组化染色在特发性炎性肌病(IIM)诊断中的应用价值。方法收集2010年3月至2018年4月在首都医科大学宣武医院神经内科行肌肉活检患者的标本29份,并通过医院电子病历系统收集患者的临床资料,包括4种IIM[皮肌炎(DM)5例,多发性肌炎(PM)5例,散发性包涵体肌炎(IBM)4例及坏死性自身免疫性肌病(NAM)5例]和2种非炎性肌病(NIM)[肌营养不良(MD)5例,dysferlinopathy肌病5例]。将标本进行苏木精-伊红(HE)染色及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ免疫组化染色。结果免疫组化染色结果显示,PM、DM及IBM患者肌肉标本MHC-Ⅰ阳性率达100.0%,NAM和MD患者肌肉标本MHC-Ⅰ阳性率为80.0%,dysferlinopathy肌病患者肌肉标本MHC-Ⅰ阳性率为20.0%。PM和IBM患者肌肉标本MHC-Ⅱ阳性率分别为40.0%、50.0%,其余类型疾病患者肌肉标本的MHC-Ⅱ免疫组化染色均呈阴性。结论相较于MHC-Ⅰ免疫组化染色,MHC-Ⅱ免疫组化染色在鉴别IIM与NIM中有较高的特异性。MHC-Ⅱ联合MHC-Ⅰ免疫组化染色对不同肌病类型的诊断有较好的临床应用价值。

胃窦癌组织中LAG-3 FGL1 MHC-Ⅱ的表达与预后的关系

目的:探索新型免疫检查点淋巴细胞激活基因3(lymphocyte-activation gene 3,LAG-3)、纤维蛋白原样蛋白1(fibrinogenlike protein 1,FGL1)、主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(major histocompatibility complex classⅡ,MHC-Ⅱ)在胃窦癌(gastric antral cancer,GAC)中的表达情况与预后的相关性。方法:收集2012年1月至2014年12月于天津医科大学肿瘤医院诊断为GAC的67例患者病理标本,分别进行石蜡切片制作,采用免疫组织化学法检测LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ三个指标的表达情况,并用统计学方法分析组间差异。采用Kaplan-Meier法评估LAG-3、FGL1、MHC-Ⅱ的表达水平与GAC患者预后之间的关系并绘制生存曲线。结果:GAC患者中,肿瘤大小<4 cm的患者和无淋巴结转移的患者LAG-3免疫细胞阳性率更高(P<0.05);女性患者MHC-Ⅱ免疫细胞阳性率更高(P<0.05)。免疫细胞中LAG-3、MHC-Ⅱ高表达的患者总生存期(overall survival,OS)较好(P<0.05);肿瘤细胞中MHC-Ⅱ高表达的患者OS、无病生存期(disease-free survival,DFS)较差(P<0.05);而FGL1在免疫细胞和肿瘤细胞中的表达与OS、DFS无显著相关性(P>0.05)。结论:GAC患者LAG-3、MHC-Ⅱ在不同区域的表达量存在差异,GAC患者LAG-3及其配体在免疫细胞的表达对预后产生积极影响,提示免疫细胞中LAG-3/MHC-Ⅱ可以作为GAC患者预后标志物,为临床个体化免疫治疗提供新的依据。

Barx2驱动口腔鳞状细胞癌肿瘤特异性MHC-Ⅱ类信号诱导CD4^(+)T/CD8^(+)T细胞活化

目的:探究BarH-样同源框蛋白2(BarH-like homeobox 2,Barx2)通过促进MHCⅡ类信号通路杀伤肿瘤细胞的机制。方法:(1)通过高通量测序,qPCR和Western Blot实验分析Barx2过表达的OSCC细胞系中CⅡTA/MHC-Ⅱ信号轴相关分子的表达量;(2)双荧光素酶实验验证Barx2与CⅡTA pⅢ启动子的结合;(3)提取人外周血单核细胞(PBMC),分别与对照组和Barx2过表达组肿瘤细胞共培养。共培养后,结晶紫染色检测肿瘤细胞的数量;应用CFSE染色标记及流式细胞学实验分析PBMC中CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞增殖活性。结果:(1)高通量转录组测序结果结合GSEA-基因集富集分析和KEGG信号通路分析发现,过表达Barx2上调了抗原加工与提呈通路MHC-Ⅱ信号分子相关因子;在Barx2过表达细胞系中,qPCR及Western blot进一步验证了上述基因表达的显著上调;(2)Barx2能直接与CⅡTA pⅢ启动子上游结合,促进主要表达于淋巴细胞的CⅡTA转录本的转录。(3)肿瘤细胞与PBMC共培养后,Barx2过表达肿瘤细胞的增殖被显著抑制;过表达Barx2的肿瘤细胞显著促进了CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞的增殖活性。结论:Barx2通过驱动CⅡTA/MHC-Ⅱ信号轴活化,促进肿瘤细胞表达以HLA-DR为主的MHC-Ⅱ类分子,从而活化CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞,发挥杀伤肿瘤细胞的作用。

ACT001通过STAT1/CIITA/MHC-Ⅱ通路发挥抗炎抗氧化活性治疗脓毒症引起的急性肺损伤

目的评价含笑内酯衍生物ACT001对脓毒症进程中急性肺损伤的治疗作用并探究其药理机制。方法动物水平上,小鼠腹腔注射LPS建立急性肺损伤模型,腹腔注射ACT001进行治疗,从小鼠个体存活状况、肺部炎症损伤及水肿情况等方面评价ACT001的药效;细胞水平上,以LPS刺激RAW264.7细胞构建模型,通过检测炎症反应和氧化应激水平探究其药理机制,并通过蛋白质组学结果分析其相关分子机制。结果动物水平上,ACT001可改善急性肺损伤小鼠生存率、减轻肺部炎症、降低血清中炎症因子水平;细胞水平上,ACT001通过抑制MHC-Ⅱ相关通路,促进RAW264.7细胞向抗炎表型极化,抑制NO和相关炎症因子产生的同时提高SOD含量并清除ROS。结论ACT001通过抑制STAT1/CIITA/MHC-Ⅱ通路,发挥抗炎和抗氧化作用治疗急性肺损伤,有望开发为治疗脓毒症引起的急性肺损伤的新药。

清化宁络方联合美沙拉秦治疗轻中度溃疡性结肠炎活动期疗效及对炎性因子和结肠黏膜组织中MHC-Ⅱ类分子表达影响

目的观察清化宁络方联合美沙拉秦治疗轻中度溃疡性结肠炎活动期患者的临床疗效及对炎性因子和结肠黏膜组织中MHC-Ⅱ类分子表达影响。方法将64例溃疡性结肠炎轻中度活动期患者随机分为2组,西药组32例给予美沙拉秦口服,中西医结合组32例给予美沙拉秦联合清化宁络方治疗,治疗1个月后,统计2组中医证候疗效、综合疗效,观察2组治疗前后血沉、C反应蛋白、TNF-α水平变化情况,免疫组化SP法检测2组治疗前后结肠黏膜组织中MHC-Ⅱ类分子表达情况。结果治疗后中西医结合组中医证候疗效、综合疗效均明显优于西药组(P均<0.05);2组治疗后血沉、C反应蛋白、TNF-α水平及结肠黏膜组织中MHC-Ⅱ类分子表达量均显著降低(P均<0.05),且中西医结合组血清TNF-α水平及结肠黏膜组织中MHC-Ⅱ类分子表达量均明显低于西药组(P均<0.05),而2组治疗后血沉及C反应蛋白水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论清化宁络方联合美沙拉秦治疗轻中度溃疡性结肠炎活动期患者疗效好,可明显减轻炎症反应,降低结肠黏膜组织中MHC-Ⅱ类分子表达。

单细胞转录组探究胃癌转移过程中MHC-Ⅱ类分子的演进缺失

目的:使用单细胞转录组数据绘制胃癌免疫微环境组成图谱,探究胃癌转移过程中MHC-Ⅱ类分子演进缺失的免疫机制。方法:在GEO数据库中获取胃癌原发癌和转移癌单细胞数据集,基于R(4.1.2)、Python(3.7),对该数据集进行分群、拷贝数变异(CNV)、拟时序、基因集变异(GSVA)分析、转录因子分析、非负矩阵分解、免疫细胞细分亚群和基因集富集分析,并结合来自TCGA等数据库的多个公共转录组数据集,验证所得出的结论。结果:拟时序分析反映MHC-Ⅱ类分子在癌症转移过程中演进缺失,转录因子分析观察到IRF1、STAT1等转录因子在原发癌中的高表达,非负矩阵分解探查到原发癌中独有的干扰素(IFN)γ表达模块,但原发癌展现了较冷的免疫微环境。免疫细胞的亚群分类展示了树突状细胞、巨噬细胞、T细胞等在微环境中的分布。细胞通讯分析显示MDSC样和SPP1+肿瘤相关巨噬细胞(TAM)抑制了转移癌中IFNγ的分泌并表现了促血管生成活性。基于这两种TAM的生物标志构建的评分在胃癌中具有预后意义(Log-Rank P<0.05)。scPAGE在较大规模的bulk转录组层面对单细胞分析获得的结果进行了验证。结论:TAM介导IFNγ分泌抑制,其在转移癌较原发癌中分泌相对较少,是MHC-Ⅱ在两者间表达出现差异的原因之一。针对MDSC样TAM和SPP1+TAM的研究可能是肿瘤免疫治疗的另一突破点。

严重胸部创伤对肺泡及间质巨噬细胞MHC-Ⅱ表达的影响

目的 观察严重胸部创伤后肺泡(AM)及间质(IM)巨噬细胞两类亚群MHC Ⅱ表达的不同变化,并探讨其意义。方法 建立严重胸部创伤模型,支气管肺泡灌洗,机械结合酶消化法分离、培养肺泡及间质巨噬细胞,动态检测创伤前、创伤后2、4、8、16、2 4h以及复合LPS攻击后肺泡及间质巨噬细胞MHC Ⅱ的表达水平。结果 利用小型多功能生物撞击机以4 0 0kPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤,能够建立稳定可靠并符合临床特点的严重胸部创伤模型;IM的MHC Ⅱ表达强于AM ,创伤复合脂多糖(LPS)刺激能抑制它们的MHC Ⅱ表达,AM在伤后4h最低,伤后2 4h恢复正常,IM在伤后8h即恢复正常并持续增高。结论 严重胸部创伤对AM、IM的MHC Ⅱ表达具有不同影响,它们在创伤后机体免疫功能紊乱的过程中具有不同作用,本研究为创伤性急性肺损伤的发病机制提供了一定的实验及理论依据。

牙鲆MHC class ⅡB基因多态性及其与鱼体抗病力关系的分析

用fmhcN1和fmhcC1引物分别从42尾感病个体和42尾抗病个体的基因组DNA中扩增MHC基因片段,扩增产物长度为268/280 bp。在268/280 bp的核苷酸序列中,有32个(11.4%)核苷酸位点是多态的。在其编码的61个氨基酸位点中,有13个位点是多态的,其中有6个位点发生在多肽结合位点上。对核苷酸替代的类型及位点进行分析,发现非多肽结合位点的非同义碱基替代率与同义碱基替代率的比值(dN/dS)(0.523)远远小于多肽结合位点的非同义碱基替代率与同义碱基替代率的比值(dN/dS)(23.091),表明氨基酸替换集中出现在exon2多肽结合位点上。分析84个个体的411个阳性克隆的测序结果,发现有13个不同的MHC classⅡB等位基因,并且分别编码13个不同的氨基酸序列。其中大部分等位基因如a,b,c,d,e,f,j,k,i,m是两个群体共有的,等位基因d在感病群体中出现的频率(23.80%)显著高于在抗病群体中出现的频率(7.14%)。而等位基因g和h只出现在13个抗病个体中,其频率分别为21.4%和9.52%;等位基因l只出现在感病群体中,其频率为19.05%。

斜带石斑鱼浸泡免疫哈维氏弧菌灭活疫苗后MHC-Ⅱ类分子的表达变化

为研究斜带石斑鱼浸泡免疫哈维氏弧菌全菌灭活疫苗后,MHC-Ⅱ类分子在鳃、皮肤、脾脏、头肾和后肠中的转录水平以及皮肤黏液和血清中的抗体滴度变化,并分析其相关性。应用荧光定量PCR和ELISA方法分别检测了斜带石斑鱼加强免疫后的2、4、7、11、14、21、28 d,5种组织中MHC-Ⅱ类分子的转录水平、皮肤黏液及血清抗体滴度随时间呈现的变化趋势。研究结果表明,以浸泡方式进行免疫,5种组织中MHC-Ⅱ类分子表达均呈现不同程度上调,其在鳃和皮肤中显示相似的动态变化,与黏液抗体滴度的变化相似。

健脾解毒方延长脾虚肝癌大鼠带瘤生存与MHCⅠ/MHCⅡ的关系

目的:探讨健脾解毒方延长脾虚肝癌模型大鼠带瘤生存及与MHCⅠ/MHCⅡ的关系。方法:105只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、肝癌模型组、脾虚模型组、脾虚肝癌模型组、胸腺五肽组及健脾解毒方低、高剂量组,进行造模和干预。实验中记录动物的体质量、生存时间、肝癌大鼠濒死状态时恶液质积分并采集标本。免疫组化与Western blot方法检测大鼠肝组织及肝癌组织MHCⅠ/MHCⅡ分子表达。结果:健脾解毒方高剂量组和胸腺五肽组累积生存率高于其余各组(P<0.05),且其恶液质评分低于其余各组(P<0.05)。各造模组中,MHCⅠ分子在肝组织中的表达水平高于癌组织,肝组织和癌组织中均以健脾解毒方高剂量组表达最强(P<0.01)。MHCⅡ分子在癌组织表达强于肝组织,肝组织中以健脾解毒方高剂量组表达最强(P<0.01),癌组织中以脾虚肝癌组表达最强(P<0.01)。结论:健脾解毒方能对抗移植瘤导致的恶液质的发生和进展,显著延长荷瘤鼠的生存时间,其作用可能与上调MHCⅠ/MHCⅡ有关。

扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元的克隆及序列分析

3头扬子鳄血样取自宣城安徽省扬子鳄繁殖研究中心。利用一对简并引物对MHCⅡ类B基因第二外元的部分片段进行扩增 ;通过克隆、单链构象多态性分析、测序 ,并将测得序列与下载的 8个物种MHC序列比对 ,确定序列差异和变异位点 ;利用MEGA软件构建NJ树 ,PAUP4 0构建MP树。结果得到 10种不同的序列 ,片段长 16 6bp。核苷酸序列中有 38个变异位点 ,氨基酸序列中有 2 3个变异位点 ;推定的抗原结合位点非同义替换 (dN)明显高于同义替换 (dS)。 10种序列的NJ树和MP树极为相似 ,均为A、B两个分支 ,两个分支明显的特异性位点核苷酸序列中有 9个 ,氨基酸序列中有 7个。表明扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元有较高的多态性 ,有利于扬子鳄饲养种群的遗传保护。

糖皮质激素对活化后小胶质细胞株N9中MHC-Ⅱ和OX40L表达的影响

目的研究糖皮质激素对炎症刺激活化后的小胶质细胞株N9表面分子MHC-Ⅱ和OX40L表达的影响。方法脂多糖(LPS)联合小鼠γ-干扰素刺激N9细胞活化,采用RT-PCR、免疫荧光检测N9活化前后OX40L的表达。糖皮质激素及其受体阻断剂RU-486处理活化的N9细胞后,用流式细胞术(FACS)检测MHC-Ⅱ、OX40L的表达变化。结果N9活化前OX40L mRNA和蛋白均有组成性表达,活化后MHC-Ⅱ和OX40L表达显著上调(P<0.05),糖皮质激素处理后与活化组比较两分子表达下调(P<0.05),加入RU-486又可使两分子表达上调。结论小胶质细胞N9活化后MHC-Ⅱ、OX40L表达显著升高,而糖皮质激素可通过抑制小胶质细胞MHC-Ⅱ和OX40L表达拮抗小胶质细胞的抗原呈递功能,从而降低由T细胞活化介导的损伤效应。

MARCH1在多器官功能障碍综合征病程中对脾脏树突细胞MHC-Ⅱ类分子泛素化作用的研究

目的观察多器官功能障碍综合征(MODS)小鼠脾脏树突细胞(DCs)中MARCH1和MHC-Ⅱ类分子的蛋白及mRNA表达情况,探讨MARCH1对MHC-Ⅱ类分子的泛素化调控作用。方法 110只C57BL/6小鼠随机分为1、3、5、7、10d组和正常对照组,前5个实验组小鼠采用腹腔注射酵母多糖法复制MODS模型(每组20只),正常对照组(10只)不做特殊处理。使用磁珠和Mini MACS分选磁场分离出小鼠脾脏DCs,分别采用Western blotting和Real Time PCR检测脾脏DCs中MARCH1和MHC-Ⅱ类分子的蛋白及mRNA表达情况,并观察其变化规律与病程的关系。结果脾脏DCs中MHC-Ⅱ类分子蛋白的表达在MODS 1d时即明显升高并达到峰值(P<0.05),而后逐渐下降,至10d时达到最低(P<0.05)。MHC-Ⅱ类分子mRNA的表达在整个病程中无明显变化(P>0.05)。MARCH1蛋白表达在MODS 1d时即显著降低(P<0.05),后开始回升,至7d时达到较高水平,而在10d时又再次下降,但与正常对照组相比,均无统计学差异。MARCH1 mRNA表达的变化与蛋白表达变化规律一致。结论在MODS病程中,MHC-Ⅱ类分子和MARCH1蛋白表达变化的趋势相反,MARCH1可能通过泛素化MHC-Ⅱ类分子来调控其表达水平,进而调控DCs的成熟状态及启动免疫应答反应。

MHC-Ⅱ^+/CD14^+对大鼠免疫功能监测及预后预测的价值

目的观察盲肠结扎穿孔(CLP)大鼠MHC-Ⅱ+/CD14+的变化趋势及其与动物死亡的关系,探讨MHC-Ⅱ+/CD14+对脓毒症大鼠免疫功能监测及预后预测的价值。方法采用大鼠经典CLP脓毒症模型,40只实验动物随机均分为正常对照组(C组)、假手术组(S组)、盲肠穿孔1孔组(P1组)和盲肠穿孔2孔组(P2组)。S、P1、P2组动物在制模成功后1、2、3、4d抽血,C组仅在第4d抽血,流式细胞仪检测MHC-Ⅱ+/CD14+水平,并记录每天各组动物死亡只数。同时根据MHC-Ⅱ+/CD14+水平分为≥40%组、30%～40%组、<30%组,记录各组动物死亡数目。结果采用Chiss软件进行统计学分析。结果与C组、S组比较,P1组在制模成功后第2、3、4天,P2组在制模成功后第1、2、3、4天累计死亡数均明显增加(P<0.05),而C组与S组间、P1组与P2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与C组、S组比较,P1组、P2组CLP小鼠MHC-Ⅱ+/CD14+水平在制模成功后第1、2、3、4天均明显下降(P<0.05或P<0.01),第2天为最低值,且P2组较P1组下降更明显(P<0.01),但C组与S组间比较差异无统计学意义。MHC-Ⅱ+/CD14+水平<30%组死亡数明显高于≥40%组(P<0.05)及30%～40%组(P<0.05),而≥40%组与30%～40%组间比较差异无统计学意义。结论 MHC-Ⅱ+/CD14+水平可用于脓毒症大鼠免疫功能状态的监测及预后预测。

CD4^+T细胞对MHC-Ⅱ分子的识别及其生物学意义

诸多研究表明MHC-Ⅱ类分子在启动应答中起关键作用,提示初始CD4+T细胞对MHC-Ⅱ类分子不仅是在抗原肽识别方面,而且在启动免疫应答中也起着重要的作用。通过转换认识角度进行分析,作者认为有关识别时MHC-Ⅱ类分子的差异可能与启动不同的免疫过程有关,是很多复杂的免疫现象的基础。

MHC Ⅱ类分子在肝细胞癌组织的细胞定位与术后复发关系的研究

目的研究MHCⅡ类分子在肝细胞癌(HCC)组织中的细胞定位,探讨MHCⅡ类分子在HCC组织中的表达与术后复发的关系。方法采用双重免疫组化方法对术后3年内复发和不复发HCC患者的原发瘤组织石蜡切片染色,随机选取视野检测MHCⅡ分子表达,然后统计分析。结果 MHCⅡ分子在术后3年内不复发HCC组织的表达高于1～3年内复发组织(38.5%vs 12.2%,P<0.05),MHCⅡ分子在HCC组织中主要表达在浸润的巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)等。MHCⅡ分子表达与HCC患者的性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤数目、有无包膜、门静脉癌栓、乙肝表面抗原、Edmonson分级等因素无明显相关(P>0.05)。结论 MHCⅡ分子与HCC的术后3年内是否复发风险密切相关,HCC组织中MHCⅡ分子高表达患者3年内不易复发。提示MHCⅡ分子可能可以作为HCC判断预后的分子指标之一。

绵羊MHCⅡ类基因遗传多态性研究进展

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是广泛存在于脊椎动物体内的一类高度紧密连锁的基因群,绵羊MHC又称为绵羊淋巴细胞表面抗原(ovine lymphocyte antigen,OLA),位于绵羊20号染色体上,分为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类区域,其中MHCⅡ类基因具有高度的基因多态性。文章综述了绵羊MHCⅡ类基因的分子结构及遗传多态性,重点总结了近十年来国内外不同绵羊品种MHCⅡ类基因遗传多态性的研究进展,并对绵羊MHCⅡ类基因未来的研究重点进行了展望。

乌龟MHCⅡ类B基因第二外显子的克隆及序列分析

利用一对兼并性引物扩增了乌龟MHCⅡ类分子B基因第二外显子的部分片段,并对PCR产物进行了克隆和测序,结果得到8种长度为166 bp的不同序列。经分析,序列中有84个变异位点,核苷酸的非同义替换(dN)多于同义替换(dS),造成39个位点氨基酸的改变。氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近。利用MEGA、PAUP软件分别构建NJ树和MP树,两种树极为相似,均分为两支。同一个体中出现有多种序列,提示乌龟MHCⅡ类分子B基因可能存在着座位重复。研究表明:乌龟MHCⅡ类分子B基因第二外显子有较高的多态性,有利于乌龟野生种群的遗传保护。