靶向CⅡTA基因siRNA对大鼠角膜基质细胞MHCⅡ基因表达影响的研究

目的:探讨靶向主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类抗原转录激活因子(MHCⅡtransactivator CⅡTA)的化学合成小干扰RNA(small interfering RNA)抑制大鼠角膜基质细胞表面的MHCⅡ类抗原表达的可行性。方法:设计并合成靶向CⅡTA基因的5条siRNA,分离并培养大鼠角膜基质细胞,经重组大鼠IFN-γ刺激后,在阳离子脂质体的介导下,将siRNA转染大鼠角膜基质细胞。于转染后24h收集细胞,用荧光定量PCR方法检测CⅡTA和MHCⅡmRNA水平的变化;流式细胞仪检测MHCⅡ抗原表达的变化。结果:大鼠角膜基质细胞经重组大鼠IFN-γ刺激后,CⅡTA和MHCⅡ的表达大幅增强。荧光定量PCR检测显示化学合成的5条siRNA通过脂质体转染大鼠角膜基质细胞后,均能不同程度地抑制CⅡTA和MHCⅡ的表达,与对照组具有显著差异(P<0·01)。其中siRNA-4组的抑制作用最明显,对CⅡTA、MHCⅡ基因的mRNA抑制率分别为95·10%±1·25%、82·70%±1·95%。流式细胞仪检测显示siR-NA-4组对MHCⅡ抗原分子表达抑制率为81·90%±1·23%。结论:在大鼠角膜基质细胞中,靶向CⅡTAsiRNA抑制了自身mRNA表达,并阻止其调控的MHCⅡ类分子的相应表达。从而为进一步研究利用siRNA技术抑制MHCⅡ的表达防治角膜缘移植排斥反应提供了实验依据。

RNAi干扰MHCⅡ基因表达后的骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的研究

目的 慢病毒沉默BMSCs中的MHCⅡ基因表达,再向血管内皮样细胞诱导分化;检测慢病毒感染后的BMSCs的增殖活性、分化效应及分化后的免疫原性变化。方法 从大鼠骨髓中分离、培养BMSCs,用慢病毒(LV)沉默MHCⅡ基因的表达,观察其增殖情况。使用血管内皮生长因子(VEGF)诱导感染后的BMSCs向血管内皮样细胞(VEC)分化,观察分化后细胞的形态、蛋白及mRNA是否有变化,电镜下观察细胞质是否出现Weibel-Palade小体。结果 慢病毒感染后的BMSCs生长曲线与未感染的BMSCs无明显差别,增殖活性不受影响。LV-CIITA-BMSCs、LV-NC-BMSCs及BMSCs经过诱导后细胞形态发生变化,细胞质中出现Weibel-Palade小体,诱导后BMSCs的表面标志物CD34、Ⅷ因子及Flt-1 mRNA明显高于未诱导组,各个诱导组之间无统计学意义;LV-CIITA-BMSCs的MHCⅡ蛋白及mRNA表达明显低于LV-NC-BMSCs及诱导后的BMSCs。结论 BMSCs经过慢病毒感染后,不影响其增殖活性及向VEC分化。BMSCs经过分化后,其MHCⅡ蛋白及mRNA表达升高;但是LV-CIITA-BMSCs诱导后MHCⅡ蛋白及mRNA的上升幅度较LV-NC-BMSCs及BMSCs低。

11味中药多糖提取物对不同MHCB-LβⅡ基因型鸡新城疫抗体水平和IFN-γ、IL-4含量的影响

为探讨11味中药多糖提取物对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡免疫调节作用的影响,采用PCR-RFLP方法将1日龄雄性良凤青脚麻鸡按不同MHC B-LβⅡ基因型分组,并分别给予高、中、低剂量中药多糖提取物和生理盐水,采用ELISA法测定血清中新城疫抗体水平和IFN-γ、IL-4含量。结果显示:(1)不同剂量中药多糖提取物能提高各MHC B-LβⅡ基因型鸡ND抗体水平和IFN-γ、IL-4含量,且高剂量组中AA基因型个体高于AB、BB基因型个体,中、低剂量组中AB基因型个体高于AA、BB基因型个体;(2)AA基因型个体ND抗体水平和IFN-γ含量在高剂量组高于中、低剂量组,AB、BB基因型个体ND抗体水平和IFN-γ、IL-4含量在中剂量组高于高、低剂量组。结果表明11味中药多糖提取物能不同程度促进各MHC B-LβⅡ基因型鸡ND抗体生成和细胞因子IFN-γ、IL-4的分泌,且在不同MHC B-LβⅡ基因型鸡中的最适免疫调节剂量不同。

鸭MHCⅡβ基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

据NCBI上已发表的序列设计引物,通过RT-PCR从北京鸭脾脏的总RNA中扩增得到MHCⅡβ基因,将其克隆至pMD18-T载体上,经酶切分析及测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG中,转化大肠杆菌BL21中诱导表达。蛋白纯化后,免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,经1∶100倍稀释后用于Western blot分析。结果表明:克隆得到了鸭MHCⅡβ链基因,大小为798 bp,经核苷酸测序与已登录的基因序列同源性为92%;成功构建了原核表达载体,融合蛋白得到了高效表达且纯化后纯度达95%。制备的鼠抗鸭MHCⅡβ多克隆抗体,经酶联免疫吸附实验(ELISA)与免疫印迹法(Western blot)证实抗体的效价高、特异性强,为深入研究鸭MHCⅡ奠定了基础。

绵羊MHCⅡ类基因遗传多态性研究进展

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是广泛存在于脊椎动物体内的一类高度紧密连锁的基因群,绵羊MHC又称为绵羊淋巴细胞表面抗原(ovine lymphocyte antigen,OLA),位于绵羊20号染色体上,分为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类区域,其中MHCⅡ类基因具有高度的基因多态性。文章综述了绵羊MHCⅡ类基因的分子结构及遗传多态性,重点总结了近十年来国内外不同绵羊品种MHCⅡ类基因遗传多态性的研究进展,并对绵羊MHCⅡ类基因未来的研究重点进行了展望。

鸭MHCⅡα基因的表达纯化与抗体制备

根据NCBI上已发表的序列自行设计引物,通过RT-PCR从北京鸭脾脏的总RNA中扩增得到鸭MHCⅡα基因,将其克隆至pMD18-T,经酶切分析及序列测定鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pET-28a。转化大肠杆菌BL21中诱导表达。电洗脱纯化蛋白,用于免疫昆明小鼠制备多克隆抗体。结果表明:克隆了鸭MHCⅡα基因,大小为633 bp,经核苷酸测序与已登录的基因序列同源性为99%;成功构建了原核表达载体,融合蛋白得到了高效表达且纯化后纯度可达90%,制备的鼠抗鸭MHCⅡα多克隆抗体经酶联免疫吸附试验(ELISA)与免疫印迹法(Western-blot)证实了抗体的效价高、特异性强,研究结果为研究鸭MHCⅡ分子奠定了基础。

MHC Ⅱ类基因瘤体内直接注射治疗小鼠肿瘤的研究

目的:许多基因治疗方案可以诱导产生抗肿瘤免疫反应,但是ex vivo的操作方式限制了其应用.本研究采用瘤体内直接注射MHC Ⅱ类基因的方法来诱导抗肿瘤免疫反应.方法:针对具有弱免疫原性的小鼠肥大细胞瘤P815和非免疫原性的小鼠黑色素瘤B16,在瘤体的原位注射MHC Ⅱ类基因,观察肿瘤的生长情况.结果:直接注射MHC Ⅱ类基因,使P815肿瘤的致瘤性明显下降,并且对第二次接种P815细胞具有抵抗能力;虽然对B16而言,仅注射MHC Ⅱ类基因无治疗效果,但与B7基因共同注射,却能够显著地抑制B16肿瘤的生长.结论:瘤体内直接注射MHC Ⅱ类基因可以用来进行肿瘤治疗.

异基因型和同基因型MHCⅡ类基因转染对小鼠肥大细胞瘤免疫原性的影响

目的 :提高肿瘤细胞的免疫原性。方法 :将异基因型或同基因型的MHCⅡ类基因转染至小鼠肥大细胞瘤P815中 ,用此细胞接种同系小鼠 ,1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型P815细胞 ,观察小鼠的存活情况。结果 :转同基因型MHCⅡ基因的P815细胞接种同系小鼠后 ,4/ 10不成瘤 ,而异基因型MHCⅡ基因转染组 ,10 / 10不成瘤。 1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型的P815细胞 ,同基因型转染组 2 / 4不成瘤 ,异基因型转染组 7/ 10不成瘤。结论 :研究说明MHCⅡ基因转染具有使肿瘤细胞的致瘤性下降、免疫保护能力提高的作用 ;并且异基因型比同基因型MHCⅡ类基因转染的效果更佳。

内蒙古地区布氏田鼠种群MHCⅡ类基因第二外显子的遗传分析

以MHCⅡ类基因第二外显子(MHC classⅡexon 2)为分子标记,用限制性酶切多态性和直接测序的方法对分布于内蒙古地区的8个布氏田鼠种群共460个个体进行种群遗传结构的分析.结果显示,酶切共检测到6个等位基因,13个酶切多态性位点,卡方检验显示,各种群在6个酶切多态性位点上基因型频率不符合Hardy-Weinberg平衡.序列分析显示,在长度261 bp的核苷酸序列中,有57个变异位点,定义21种单倍型,其中有1个单倍型为不同区域种群所共享,其余20个单倍型均为各区域种群所特有.7个地理种群的单倍型多样性和核苷酸多样性较高,1个地理种群较低.谱系分析显示,8个布氏田鼠地理种群分为3个进化分支,分别与采集的地理种群相吻合:同一地理种群内单倍型之间遗传差异小,而不同地理来源的单倍型之间存在较大区别.Mentel检测表明,布氏田鼠的遗传分化与地理距离呈现正相关.AMOVA分析结果同样表明地理种群之间存在差异:各区域类群间变异组分占总变异比率的60.48%,区域内种群间变异组分占总变异比率的7.78%,种群内个体间变异组分占总变异比率的28.14%;遗传分化系数和基因流分析显示,布氏田鼠种群出现一定程度的分化,但正镶白旗种群与其他种群之间遗传分化显著.布氏田鼠的这种遗传结构特点可能是该物种稳定的地下生活环境和有限的迁移造成的,且浑善达克沙漠形成布氏田鼠分化最强烈的隔离因素.

MHC Ⅱ类基因表达调控研究进展

目前认为ＭＨＣⅡ类基因的调节主要在转录水平上。已发现一系列作用于其启动子的转录因子，这些转录因子与染色体组蛋白及启动子保守序列交互作用影响ＭＨＣⅡ类基因的表达。其中，顺式作用元件与反式作用因子协同形成的蛋白—蛋白复合体起关键作用。本文对近年来在ＭＨＣⅡ类基因表达研究的长足进展作一综述。

尼罗鳄MHCⅡ类B基因第二外元的序列变异分析

利用一对简并引物扩增了尼罗鳄MHCⅡ类分子B基因第二外元的部分片段,并对PCR产物进行了克隆和测序,结果得到8种不同的序列,序列长度为166 bp;经分析,序列中有56个变异位点,核苷酸的非同义替换多于同义替换,造成30个位点氨基酸的改变,氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近。核苷酸和氨基酸序列与已报道的扬子鳄和密河鳄的MHCⅡ类B基因第二外元序列有较高的同源性,利用PAUP4.0软件构建的NJ树显示,鳄类的MHCⅡ类B基因存在跨种多态性现象。

大足鼠耳蝠MHCⅡ-DRB基因第二外显子的克隆及序列分析

为了研究大足鼠耳蝠的MHCⅡ-DRB基因第二外显子的多态性以及大足鼠耳蝠与其他物种的亲缘关系,试验采用PCR产物直接测序方法获得江西和云南两地的大足鼠耳蝠的MHCⅡ-DRB基因第二外显子序列,然后利用BioEdit、Clustal X和Mega软件对测得的序列进行分析,并将其与GenBank中的囊翼蝠、反刍类、灵长类、啮齿类等物种的MHCⅡ-DRB基因第二外显子构建系统发生树。结果表明:大足鼠耳蝠的MHCⅡ-DRB第二外显子序列大小为224 bp,编码74个氨基酸,均具有高度的多态性;江西和云南两地的大足鼠耳蝠聚集为一支,而与包括囊翼蝠在内的其他物种分离开。

吉林地区马铁菊头蝠MHCⅡ-DRB基因第2外显子的克隆及序列分析

为了研究翼手目序列中马铁菊头蝠DRB基因第2外显子的遗传多态现象,试验检测了从一个种群得到的17个蝙蝠个体。结果从17个个体中克隆获得42条不同序列,长度为263 bp(仅4例为260 bp)。经序列分析发现,部分个体存有多种序列、不同个体间存有相同序列,提示马铁菊头蝠MHCⅡ-DRB基因第2外显子可能存在着重复座位和基因共享。氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近。利用MEGA软件构建的NJ树表明,马铁菊头蝠聚为一支,而与其他动物分离。结果表明:马铁菊头蝠MHCⅡ-DRB基因第2外显子有较高的多态性,这与其他哺乳动物很相似。

溯河洄游型刀鲚MHCⅡβ基因克隆的初步研究

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是脊椎动物中高度多态的基因家族,其编码的蛋白质是适应性免疫的重要组件,其中MHCⅡβ基因表达的蛋白主要参与外源性抗体的呈递,与生物抗性及生态适应性具有重要关系。使用RACE技术首次克隆了溯河洄游型刀鲚(Coilia nasus)MHCⅡβ基因,全长为917 bp,开放阅读框的长度为765 bp,共编码254个氨基酸。通过同源性分析和分子系统进化分析发现,刀鲚MHCⅡβ氨基酸序列与其他硬骨鱼类和哺乳类的相似性在32.09%~71.79%,和鲱形目的鱼类同源性最高(71.79%)。研究结果可为溯河洄游型刀鲚MHCⅡ基因相关的多态性及生态适应等机制的研究提供理论基础。

MHC-Ⅱ^+/CD14^+对大鼠免疫功能监测及预后预测的价值

目的观察盲肠结扎穿孔(CLP)大鼠MHC-Ⅱ+/CD14+的变化趋势及其与动物死亡的关系,探讨MHC-Ⅱ+/CD14+对脓毒症大鼠免疫功能监测及预后预测的价值。方法采用大鼠经典CLP脓毒症模型,40只实验动物随机均分为正常对照组(C组)、假手术组(S组)、盲肠穿孔1孔组(P1组)和盲肠穿孔2孔组(P2组)。S、P1、P2组动物在制模成功后1、2、3、4d抽血,C组仅在第4d抽血,流式细胞仪检测MHC-Ⅱ+/CD14+水平,并记录每天各组动物死亡只数。同时根据MHC-Ⅱ+/CD14+水平分为≥40%组、30%～40%组、<30%组,记录各组动物死亡数目。结果采用Chiss软件进行统计学分析。结果与C组、S组比较,P1组在制模成功后第2、3、4天,P2组在制模成功后第1、2、3、4天累计死亡数均明显增加(P<0.05),而C组与S组间、P1组与P2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与C组、S组比较,P1组、P2组CLP小鼠MHC-Ⅱ+/CD14+水平在制模成功后第1、2、3、4天均明显下降(P<0.05或P<0.01),第2天为最低值,且P2组较P1组下降更明显(P<0.01),但C组与S组间比较差异无统计学意义。MHC-Ⅱ+/CD14+水平<30%组死亡数明显高于≥40%组(P<0.05)及30%～40%组(P<0.05),而≥40%组与30%～40%组间比较差异无统计学意义。结论 MHC-Ⅱ+/CD14+水平可用于脓毒症大鼠免疫功能状态的监测及预后预测。

西伯利亚鲟MHCⅡβ克隆、原核表达和多克隆抗体制备

旨在构建西伯利亚鲟(Acipenser baerii)MHCⅡβ基因原核表达载体高效表达,并进行多克隆抗体的制备。根据GenBank西伯利亚鲟MHCⅡβ基因序列设计引物,并加上6-His标签和酶切位点,从西伯利亚鲟脾脏细胞中克隆可读编码框(不含信号肽)部分,克隆并测序鉴定后构建Pet30α-MHCⅡβ质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导表达,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western Blot)鉴定,诱导表达的融合蛋白大小约为32 ku,能够与His抗体结合,融合蛋白主要以包涵体形式存在,在温度37℃时1 mmol/L的IPTG诱导4 h可以达到最佳表达量。将表达蛋白通过镍柱层析纯化后,制备兔多克隆抗体,抗体效价达到243 W,为深入研究西伯利亚鲟MHCⅡβ基因免疫学功能提供参考。

中国东北汉族人群变应性鼻炎患者HLA-DRB1基因多态性分析

目的分析中国东北地区汉族人变应性鼻炎（ａｌｅｒｇｉｃｒｈｉｎｉｔｉｓ，ＡＲ）患者与ＨＬＡ（ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅＡｓｙｓｔｅｍ）ＤＲＢ１等位基因的关联。方法采用聚合酶链反应序列特异性引物技术对３５例东北汉族变应性鼻炎患者的ＨＬＡＤＲＢ１等位基因进行检测，对照组为同地区９４例健康者。结果统计学分析结果显示患者组ＨＬＡＤＲＢ１０１０１．２和０３０２等位基因比正常对照组明显增高，基因频率分别为１２．８６％（相对危险性为１５．９２，校正Ｐ值＜０．０００４）和５．７１％（相对危险性为１２．００，校正Ｐ值＜０．０５），其它等位基因频率在实验组和对照组之间差异无显著性。结论提示ＨＬＡＤＲＢ１０１０１．２和ＤＲＢ１０３０２等位基因与ＡＲ关联。

梅尼埃病患者与组织相容性白细胞抗原-II类基因关联的研究

目的 探讨梅尼埃病 (Meniere′sdisease)患者与组织相容性白细胞抗原 (histocompatibilityleukocyteantigen ,HLA) II类基因DRB1等位基因的关联。方法 采用聚合酶链反应 序列特异性引物(polymerasechainreaction sequencespecificprimers,PCR SSP)技术。测试 6 0例梅尼埃病患者和 85名健康人对照。结果 患者组HLA DRB1 3+ 5 + 6 + 8基因组集团总数高于健康对照组 ,相对危险性为 1.99 ,P <0 .0 5 ,患者组HLA DRB1 0 9明显低于健康对照组 ,相对危险性为 0 .17,P <0 .0 1。结论 梅尼埃病患者HLA DRB1 0 9显著下降 ,提示HLA DRB1 0

日本血吸虫卵黄铁蛋白基因免疫在不同处理小鼠诱导免疫应答的观察

【目的】研究日本血吸虫卵黄铁蛋白DNA免疫在两种处理小鼠诱导的免疫应答及其保护作用。【方法】免疫小鼠分两大组进行 :实验Ⅰ组小鼠有预感染 ,实验Ⅱ组小鼠没有预感染。将构建的携带日本血吸虫卵黄铁蛋白基因的重组质粒pLXSN Fer1经左后腿肌肉注射BALB/c小鼠 ,共免疫 2次 ,间隔 2周。末次免疫后 5周以血吸虫尾蚴攻击感染 ,6周后剖杀小鼠 ,计数成虫负荷及肝组织虫卵数。设空载质粒免疫组为对照组。【结果】免疫小鼠后在实验Ⅰ组主要诱生IgG1和IgG3,在实验Ⅱ组主要诱生IgG2a和IgG2b ;实验组产生较高水平的IgA和IFN γ应答。pLXSN Fer1免疫小鼠获得一定程度的减虫率 (2 6 47% ,34 0 8% )和减卵率 (4 0 0 2 % ,36 83% )。【结论】日本血吸虫卵黄铁蛋白在两种不同处理小鼠均能产生一定程度的保护作用 ,有可能成为有价值的疫苗候选分子 。