CPP Tat_(49-57)促进外源CTL表位进入MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的机制研究

目的研究穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)促进外源CTL表位进入抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的效应及呈递机制。方法应用多肽固相合成技术,将源于HIV-Tat的穿膜序列Tat49-57连接在H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的氨基端形成融合肽即Tat49-57-CTL257-264,同时合成该表位和氨基端自然延伸的对照肽NH2 extended-OVA257-264。采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测APC对各肽的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学,并进行MHC-Ⅰ类抗原呈递阻断和TAP依赖性实验。结果在所测时间点,APC对于Tat49-57-CTL257-264的呈递强度均明显高于NH2 extended-OVA257-264;氨基肽酶抑制剂Bestatin可部分抑制APC对于Tat49-57-CTL257-264的MHC-Ⅰ类抗原呈递,而蛋白酶体抑制剂Lactacystin则无抑制效应;Tat49-57-OVA257-264可被TAP缺陷细胞RMA-S内MHC-Ⅰ类分子有效呈递,其呈递强度远超过RMA-S细胞对NH2extended-OVA257-264的呈递。此外,RMAS固定后则丧失对Tat49-57-OVA257-264和NH2 extended-OVA257-264的MHC-Ⅰ类限制性呈递能力,但其表面的“空”MHC-Ⅰ类分子仍可呈递单纯表位肽OVA257-264。结论CPP Tat49-57可有效促进与之融合的CTL表位肽被细胞内MHC-Ⅰ类分子提呈,表现为动力学显著增强,且该过程表现为蛋白酶体/TAP非依赖、氨基肽酶依赖。

ER滞留信号肽对外源CTL表位进入胞内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的促进作用

目的探讨哺乳动物内质网(endoplasmic reticulum,ER)滞留信号肽(retrieval signal sequence)能否促进外源CTL表位肽进入抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径。方法应用多肽固相合成技术将哺乳动物内质网滞留信号——赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Lys-Asp-Glu-Leu,KDEL)基序融合在H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的羧基端,同时合成该表位和氨基端自然延伸四个氨基酸(TEWT)的对照肽OVA257-268。选择巨噬细胞系Ana-1作为本研究的APC,采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测各抗原肽在Ana-1内的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学。结果羧基端KDEL基序可明显增强与之偶联的CTL表位在APC内的MHC-Ⅰ类抗原呈递效率,并且显著延长APC表面MHC/肽复合物的呈递时间。结论羧基端KDEL基序修饰是将外源肽有效导入APC内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的一个简单有效的新策略,可为肿瘤治疗性肽疫苗的分子设计与研究提供新思路和实验依据。

MHC-Ⅰ类分子抗原呈递相关蛋白与乙肝相关性研究

目的探讨正常肝组织与乙型肝炎中TAP1、TAP2、HSP70、HSP90、CNX、β2-MG蛋白表达及相关关系。方法以内源性生物素阻断S-P法来检测32例乙肝患者和16例健康对照者石蜡包埋肝组织的TAP1、TAP2、HSP70、HSP90、CNX、β2-MG蛋白表达情况。结果β2-MG、TAP1、HSP70、HSP90、CNX蛋白在乙肝组表达高于正常组(P均<0.05);通过相关性分析发现,TAP2蛋白与HSP70蛋白在正常组中呈相关性(χ2=16.000,P=0.008)。结论TAP1、TAP2、HSP70、HSP90、CNX、β2-MG蛋白均在乙肝组表达高于正常组(P<0.05),提示这些蛋白均参与MHC-Ⅰ类分子的乙肝病毒抗原处理及提呈过程,并且可以做为诊断乙肝的临床指标。

卵巢癌细胞MHC-Ⅰ类抗原表达与肿瘤微环境免疫细胞分布关系

目的 探讨卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达与肿瘤微环境免疫活性细胞分布的关系 ,了解机体肿瘤微环境免疫功能状态。方法 用流式细胞仪检测卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达 ,同时用免疫组化方法检测肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布情况。结果 卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达存在不同程度的下降或缺如 ,且与肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布呈正相关 ,前者r=0 .846 ,P =0 .0 0 0 1,后者r =0 .738,P =0 .0 0 0 1。结论 上皮性卵巢癌细胞MHC Ⅰ类抗原分子的表达影响肿瘤微环境中浸润免疫细胞数 ,进而影响肿瘤微环境免疫监视能力。检测MHC Ⅰ类分子表达可为肿瘤浸润淋巴细胞临床过继治疗选择合适病例提供实验依据。

MHC-Ⅰ类链相关基因A真核表达载体的构建及稳定转染舌鳞癌细胞的实验研究

目的构建人类MHC-Ⅰ类链相关基因A(MICA)的真核表达载体,转染人舌鳞癌脑高转移Tca8113-Tb细胞,建立稳定过表达MICA基因的口腔鳞癌细胞系。方法采用PCR技术扩增pCMV-SPORT6-MICA中编码MICA基因的cDNA序列,重组至有绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1,构建最终的表达载体pEGFP-N1-MICA,脂质体法转染Tca8113-Tb细胞,G418筛选,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,有限稀释法建立稳定过表达MICA基因的Tca8113-Tb细胞系,RT-PCR、real time PCR和免疫细胞化学检测MICA在该细胞中的表达。结果通过PCR技术获取了MICA基因并成功克隆入载体,测序鉴定该序列与GenBank中的序列相同。转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达,RT-PCR、real time PCR及免疫细胞化学检测到目的基因MICA在转染细胞中为过表达。结论 pEGFP-N1-MICA真核表达载体的成功构建与稳定转染Tca8113-Tb细胞系的建立,为进一步研究该基因的功能奠定了良好的实验基础。

口腔鳞癌细胞过表达MHC-Ⅰ类链相关蛋白A对自然杀伤细胞与细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性影响的实验研究

目的探讨口腔鳞癌细胞过表达MHC-Ⅰ类链相关蛋白A(MICA)对自然杀伤细胞(NK)与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的影响。方法通过绘制细胞生长曲线、检测细胞周期、进行平板集落形成率及裸鼠皮下成瘤等方法对稳定转染并过表达MICA的口腔鳞癌细胞株进行生物学特性鉴定。采用乳酸脱氢酶释放法及流式细胞术分析口腔鳞癌细胞过表达MICA对NK与CTL细胞杀伤活性及自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)受体表达的影响。结果口腔鳞癌细胞转染MICA基因后主要生物学特性未发生改变,但能显著增强NK与CTL细胞杀伤活性并上调其表面NKG2D的表达,与未转染及转染空白载体的细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MICA可作为口腔鳞癌免疫基因治疗的潜在靶标,值得进一步研究。

携带非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A穿膜区等位基因中晚期食管癌患者对NK细胞免疫治疗的敏感性高

目的:探讨非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A(MHC classⅠ-related molecules A,MICA)穿膜区等位基因对中晚期食管癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗疗效的影响。方法:选取福建省肿瘤医院2013年4月至2015年10月收治的中晚期(TNMⅢ-Ⅳa期)食管癌患者152例,均在姑息性手术后行全身化疗,根据患者MICA穿膜区等位基因是否为A5.1分为4组:(1)A5.1化疗+NK细胞治疗(A5.1+NK)组;(2)A5.1单纯化疗(A5.1)组;(3)非A5.1化疗+NK细胞治疗(no A5.1+NK)组;(4)非A5.1单纯化疗(no A5.1)组,观察各组患者临床疗效。构建食管癌组织标本MICA等位基因A5.1的真核表达载体p TE-1A5.1,转染食管癌TE-1细胞株;Western blotting检测p TE-1A5.1转染对TE-1细胞MICA蛋白表达的影响,LDH法检测TE-1细胞转染p TE-1A5.1前后对NK细胞杀伤敏感性的变化,ELISA法检测食管癌患者血清可溶性MICA及转染p TE-1A5.1前后TE-1细胞上清中可溶性MICA含量。结果:经过3年的随防,A5.1+NK组患者中位总生存期(medium overall survival,m OS)为15.0个月,A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组为22.4个月,no A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.05)。经Cox多因素回归分析发现,患者年龄、性别、ECOG评分及基因型与预后均无明显相关(P>0.05),将基因类型与是否NK细胞治疗进行交叉分析,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.01)。转染p TE-1A5.1后TE-1细胞内MICA表达显著升高,培养液上清可溶性MICA分泌明显增加[(256.2±45.3)vs(45.3±11.5)pg/ml,P<0.01];与转染前相比,NK细胞对过表达MICA的TE-1细胞的杀伤率明显降低[(29.5±7.2)%vs(42.5±7.1)%,P<0.05]。结论:相对中晚期食管癌MICA穿膜区A5.1等位基因患者,非A5.1基因患者手术后化疗联合NK细胞的疗效较好,其机制与其不容易产生可溶性MICA密切相关。

湖南地区白血病MHC-Ⅰ类链相关基因A微卫星多态性分析

目的:探讨MHC-Ⅰ类相关链基因A(MHC class-Ⅰchain related gene A,MICA)与湖南地区白血病之间的相关性。方法:应用荧光聚合酶链反应-基因扫描技术和聚合酶链反应-序列特异性引物技术分析,对62例白血病患者和112名正常人群进行MICA基因第5外显子微卫星等位基因分型及MICA基因缺失检测。结果:慢性粒细胞白血病组(n=35)的MICA*A5基因频率显著低于正常对照组(RR=0.635,P=0.0380);急性淋巴细胞性白血病组(n=13)的MICA*A4基因频率显著低于正常对照组(RR=0.120,P=0.0297);而在急性非淋巴细胞性白血病组(n=14),MICA*A5基因频率显著高于正常对照组(RR=2.229,P=0.0218)。结论:本文数据显示,MICA-STR多态性与湖南地区白血病之间存在相关性;不同病理类型的白血病相关格局有所不同。

MHC-Ⅰ类链相关基因A修饰的口腔鳞癌细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的:研究MHC-Ⅰ类链相关基因A(MHC classⅠchain-related gene A,MICA)修饰的口腔鳞癌疫苗诱导机体抗肿瘤免疫应答的有效性并探讨其作用机制。方法:灭活稳定转染MICA基因的口腔鳞癌细胞,制备成肿瘤疫苗,通过腹腔注射严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)鼠,观察其对皮下移植瘤生长的抑制作用;应用流式细胞术和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放法检测免疫重建荷瘤SCID鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和脾细胞表面NKG2D的表达及对肿瘤靶细胞的杀伤活性。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学处理。结果:转染MICA基因的口腔鳞癌疫苗能显著抑制免疫重建荷瘤SCID鼠皮下移植瘤的生长,上调PBMC和脾细胞表面NKG2D的表达,并增强对肿瘤靶细胞的杀伤活性,与未转染组及转染空白载体组比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:过表达MICA蛋白的口腔鳞癌疫苗能显著增强机体的抗肿瘤免疫应答能力,MICA有望作为口腔鳞癌免疫基因治疗的潜在靶标。

人类主要组织相容抗原Ⅰ类分子在涎腺腺样囊性癌中的表达

目的:探讨人类主要组织相容抗原(MHC)Ⅰ类分子(HLA-Ⅰ,HLA-G)在腺样囊性癌发生中的意义。方法:应用HLA-I、HLA-G特异性单抗,通过免疫组织化学的方法检测42例腺样囊性癌、30例正常涎腺组织内HLA-Ⅰ、HLA-G抗原的表达。结果:正常涎腺组织内HLA-Ⅰ抗原表达阳性,HLA-G抗原基本上不表达。腺样囊性癌内HLA-Ⅰ类抗原的表达显著低于正常涎腺组织(χ2=17.17,P<0.05),同时HLA-G抗原的表达显著高于正常涎腺组织组(χ2=13.18,P<0.05),但二者与腺样囊性癌的临床分型并无明确的关系。结论:HLA-Ⅰ抗原表达降低和HLA-G抗原表达上调可能参与了腺样囊性癌的发生过程。HLA-Ⅰ、HLA-G抗原可作为腺样囊性癌发生过程中的标志物,对判断腺样囊性癌的预后有一定价值。

人食管癌TE-1细胞MHC-Ⅰ相关抗原肽的初步研究

目的寻找TE1细胞MHCⅠ类分子提呈的抗原肽。方法用弱酸洗涤法获得TE1细胞表面与MHCⅠ类分子结合的抗原肽,经SepPakC18柱、Centrion3超滤器和RPHPLC去盐纯化后,用负载该抗原肽的树突状细胞刺激生成肿瘤特异性杀伤细胞,以Cr51释放法测定CTL的杀伤活性。结果高效液相色谱图显示多个峰;负载抗原肽DC刺激的CTL比未负载抗原肽DC刺激的CTL对TE1细胞杀伤率高,两者差异有统计学意义;负载抗原肽DC刺激的CTL对与抗原肽孵育的T2细胞比对未经与抗原肽孵育的T2细胞杀伤率高,两者差异有统计学意义。结论弱酸洗涤法可从TE1细胞上获得有效的抗原肽;混合抗原肽中有可与HLAA2分子结合并能激发CTL的抗原肽。

宫颈病变中抗原呈递元件成员蛋白和人类白细胞共同抗原Ⅰ类分子表达的关系

抗原呈递元件（APM）成员蛋白作为一组抗原呈递相关功能蛋白,在协助人类白细胞共同抗原（HLA）Ⅰ类分子组装、负载和提呈内源性抗原肽,介导抗病毒T细胞免疫中发挥着重要作用[1].其成员蛋白抗原处理相关转运体（TAP）负责将内源性抗原肽向内质网腔转运.TAP相关蛋白对HLA-Ⅰ类分子在内质网中的装配发挥关键作用[2].分子伴侣钙连接蛋白和钙网蛋白以及疏基二硫键氧化还原酶Erp57协助新合成的HLA-Ⅰ蛋白正确折叠和组装[3].人乳头状瘤病毒（HPV）是宫颈癌发生的始动因素,也可能通过协助肿瘤细胞影响HLA-Ⅰ基因表达调控.因此,探讨HPV感染引起宿主HLA-Ⅰ类分子表达缺失与APM成员表达情况有无关联,是揭示肿瘤的分子机制、疫苗治疗、建立肿瘤生物标志谱体系的关键.我们通过检测宫颈上皮内瘤变（CIN）和宫颈癌组织中APM成员蛋白及HLA-Ⅰ类分子的表达情况,分析其与HPV16感染的相关性,从而探讨宫颈病变中HLA-Ⅰ类分子表达下调的机制.

维吾尔族和汉族子宫颈癌患者病变组织主要组织相容性复合物Ⅰ类分子抗原呈递相关蛋白的表达

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，在新疆维吾尔族妇女宫颈癌发病率高，属于宫颈癌高发区之一，其发病率及病死率明显高于生活在同一环境的其他民族。主要组织相容性复合物（major histoeompatibility complex，MHC）是介导抗病毒T淋巴细胞免疫的关键分子，呈递细胞内产生的内源性抗原（如病毒感染细胞、肿瘤细胞的抗原）与MHC-Ⅰ类分子结合后最终呈递至细胞表面供T淋巴细胞识别，其组装和负载过程中需要一系列的相关蛋白参与，

MHC-I链相关基因A的生物学特性及与疾病的关联

MHC-I链相关基因A(MICA)是近年来发现的一个新基因,位于MHC-I类区域,包含多个基因位点,具有高度多态性。已发现的MICA等位基因多达50余个,不同人群之间MICA各等位基因的分布存在差异。MICA基因所编码分子的表达具有组织特异性,此外还与基因型相关,某些基因型的MICA分子在细胞表面表达可出现缺陷。与MHC分子类似,MICA分子在机体中也发挥着一定免疫学作用,MICA分子通过与相应受体NKG2D结合可传递活化信号,活化γδT细胞、NK细胞等参与天然免疫的细胞。研究发现,MICA基因与多种自身免疫病及肿瘤的发病相关,包括白塞氏病、强直性脊柱炎、1型糖尿病、直肠癌和白血病等,并可能参与了肿瘤细胞的免疫逃避机制。

抗原处理相关转运体(TAP)的结构和功能研究进展

抗原处理相关转运体(TAP)属于ABC(ATP-binding cassette)转运体超家族的B亚家族,是由主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)上2个紧密连锁的基因TAP1和TAP2编码蛋白组成的异二聚体,位于内质网和顺式高尔基膜上,功能是将抗原肽从细胞质转运进入内质网池,组装到MHC I类分子上构成复合体。TAP蛋白的缺乏和突变会影响抗原肽的提呈,最终损害免疫应答功能。

三肽基肽酶Ⅱ(TPPⅡ)对抗原的提呈作用机制研究进展

三肽基肽酶Ⅱ(Ripetidyl PeptidaseⅡ,TPPⅡ)是存在于细胞质中的一种多功能丝氨酸蛋白酶,主要协助蛋白酶体和其他的胞外酶并且参与蛋白周期代谢。最近的数据显示,TPPⅡ对MHC-Ⅰ类分子抗原表位的产生与破坏均有重要作用,但是TPPⅡ在MHC-Ⅰ类抗原递呈中的具体作用机制尚有待进一步研究。本文综述TPPⅡ的细胞生物学特征,着重探究TPPⅡ在MHC-Ⅰ类抗原递呈中作用,并且指出TPPⅡ在新型疫苗设计上具有重要的指导意义。

小鼠胰岛细胞MHC－DR抗原的诱导表达

本文报告肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）和ｒ－干扰素（ＩＦＮ－ｒ）诱导小鼠胰岛细胞ＭＨＣ－ＤＲ抗原表达对胰岛素分泌的影响。实验结果表明：（１）当ＴＮＦ浓度为５０～１００Ｕ／ｍｌ时未见胰岛细胞表达ＭＨＣ－ＤＲ抗原，而５０Ｕ／ｍｌｒ－ＩＦＮ可诱导少量胰岛细胞（８．５±２．９％）表达ＭＨＣ－ＤＲ抗原；（２）１００Ｕ／ｍｌＴＮＦ和１００Ｕ／ｍｌｒ－ＩＦＮ合并使用，ＭＨＣ－ＤＲ抗原阳性细胞明显增多（８０．２５±４．１１％）；（３）两种因子单独或合并作用均能使体外培养的胰岛细胞的胰岛素分泌量增加（Ｐ＜０．０１）。上述结果提示，胰岛细胞ＭＨＣ－ＤＲ抗原的诱导表达本身并不影响其分泌胰岛素的功能。

湖南地区鼻咽癌MHC-Ⅰ类链相关基因A第5外显子微卫星多态性研究

目的研究MHCⅠ类链相关基因A(MHCclassⅠchainrelatedgeneA,MICA)第5外显子微卫星多态性与湖南地区鼻咽癌之间的相关性。方法应用荧光聚合酶链反应基因扫描技术和聚合酶链反应序列特异性引物技术分析127例湖南地区鼻咽癌患者和112名正常人群MICA基因第5外显子微卫星等位基因及MICA基因缺失(MICADel)频率。结果MICAA9表型频率在患者组(45/127)高于对照组(20/112),相对风险值(relativerisk)为2.524(P=0.001,Pc=0.006);MICAA5.1表型频率在患者组(51/127)低于对照组(69/112),相对风险值为0.418(P=0.0004,Pc=0.0026)。进一步分析发现,MICAA9在男性患者组的表型频率(35/101)高于男性对照组(11/78),相对风险值为3.23(P=0.00095,Pc=0.006);MICAA5.1在男性患者组的表型频率(39/101)低于男性对照组(49/78),相对风险值为0.372(P=0.0007,Pc=0.004);各MICASTR等位基因频率在女性患者组与女性对照组之间的差异无统计学意义(Pc>0.05)。结论湖南地区MICASTR等位基因多态性与鼻咽癌相关,MICAA9是该人群男性个体的一个鼻咽癌遗传易感标记。

转移的小鼠MHC-Ⅰ类基因在受体小鼠体内的较长期表达

目的 探讨表达供体MHC Ⅰ类基因的造血细胞嵌合体回输受体小鼠后 ,能否在受体内较长时间表达。方法 由逆转录病毒载体介导 ,将供体小鼠 (C5 7BL 6 )的MHC Ⅰ类基因导入受体小鼠(BALB c)的造血细胞 ,并用聚合酶链反应、逆转录 聚合酶链反应和流式细胞仪进行检测。结果 逆转录病毒载体重组质粒转染的受体BALB c小鼠造血细胞及其形成的CFU GM中均整合了供体小鼠的MHC Ⅰ类基因 ,且能转录为mRNA ,在其细胞膜上均有MHC Ⅰ类抗原的表达。结论 MHC Ⅰ类基因已稳定地整合进受体小鼠造血细胞的基因组内 ,且可以在受体内表达较长时间。