构建人MHC-Ⅱ类基因反义RNA的逆转录病毒重组体

目的：探讨运用反义ＲＮＡ技术降低脐血细胞ＭＨＣ－Ⅱ类基因的表达是否能有效减少ＧＶＨＲ发生的危险程度，为临床上进行脐血移植降低脐血干细胞的移植物抗宿主反应提供了理论依据和实验基础。方法：应用分子克隆技术构建了含人ＨＬＡ－ＤＲβ基因的逆转录病毒表达载体，经过狭缝杂交、电泳分析、酶切图谱分析鉴定。结果：获得了ＨＬＡ－ＤＲβ基因反义ＲＮＡ重组体。结论：构建人ＭＨＣ－Ⅱ类基因反义ＲＮＡ的逆转录病毒重组体。

MHC-Ⅱ类基因在高容量血液滤过防治多器官功能障碍综合征中的作用

目的 探讨MHC-Ⅱ类基因在高容量血液滤过治疗多器官功能障碍综合征中的作用.方法 建立二次打击猪MODS模型.19只雄性家猪随机分为实验组（HF组,n=10）和对照组（M组,n=9）.M组给予失血性休克、再灌注损伤、内毒素血症复合因素造模;HF组在模型建立后给予高容量血液滤过.观察7 d后处死存活动物,取脾组织用Trizol法提取总RNA.设计SLA-DQA（猪MHC-Ⅱ类基因）引物序列,逆转录构建cDNA,用实时荧光定量PCR（Real Time PQ-PCR）检测SLA-DQA mRNA的表达量.UVP计算机图像分析系统绘出标准曲线.结果 HF组动物死亡率为2/10;有2例发生MODS,发生率为2/10.M组SLA-DQA mRNA拷贝数为（1.110±0.496）×103,HF组拷贝数为（2.859±0.755）×103,P=0.045,两组相比有显著性差异.结论 MODS模型复制满意,HVHF治疗后动物的MODS发生率和死亡率下降.MHC-Ⅱ类基因滤过后表达上调,可能与反式转录因子（CⅡTA）的调控和TNF-α、IL-10等多种细胞因子的释放有关.

非肥胖型糖尿病小鼠胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子的表达

目的研究非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子表达水平,探讨胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子在中枢免疫耐受中的作用。方法对NOD小鼠用GA-PAP试剂盒检测血糖;尿糖试纸检测尿糖;ELISA间接法检测IAA的含量;光镜观察胰岛的组织学改变情况;MTT法检测胸腺T淋巴细胞功能;ELISA夹心法检测胸腺细胞IL-4、IFN-γ分泌水平;流式细胞术检测胸腺细胞MHC-Ⅱ类分子表达水平;RT-PCR法检测胸腺异位基因的表达水平。结果NOD小鼠血糖水平与正常BALB/c小鼠差异无显著意义,尿糖水平均为阴性;NOD小鼠自身抗体水平与正常BALB/c小鼠差异无显著意义;与对照组相比,NOD小鼠胰岛数量减少,分布稀疏,胰岛细胞数亦减少,同时有大量炎细胞浸润;NOD小鼠胸腺细胞对ConA刺激的应答水平与正常BALB/c小鼠差异无显著意义;NOD小鼠胸腺细胞IFN-γ的分泌与正常BALB/c小鼠差异无显著意义,而IL-4的分泌能力明显低于正常BALB/c小鼠;NOD小鼠胸腺内Insulin水平显著减少,而GAD67和PLP水平无显著变化;NOD小鼠MHC-Ⅱ类分子的表达水平明显下降。结论NOD小鼠在糖尿病发病前期存在着胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子表达缺陷,表明胸腺异位基因及MHC-Ⅱ类分子在中枢免疫耐受中起着重要作用。

支气管哮喘与人类MHC-Ⅱ类基因的关联研究

目的 探讨支气管哮喘病 (bronchialasthma,BA)易感的分子机制并确立一种较为实用的MHC -DQ基因的检测方法。方法 采用聚合酶链式反应和顺序特异性引物 (PCR -SSP)基因分析方法 ,对 31例支气管哮喘病患者及 30例无血缘关系的健康人的人类主要组织相容性复合体 (MHC -Ⅱ类 )DQ各等位基因及亚基因进行检测分析 ,并将该方法与其它检测MHC -Ⅱ类基因的方法进行比较。结果 ①MHC -DQB1 0 30 3(RR =4 2 8,P <0 0 1)和DQB1 0 6 0 1(RR =3 15 ,P <0 0 1)基因与BA病呈正相关。②MHC -DQB1 其它各等位基因未见异常。结论 MHC -DQB1 0 30 3和MHC -DQB1 0 6 0 1基因为北方汉族人BA病的致病易感基因。

真核生物Ⅱ类基因的转录起始

真核生物Ⅱ类基因的转录起始是一个非常复杂并且受到严格调控的过程 .它涉及到染色体结构的改变、顺式作用元件和反式作用因子相互作用等多种过程 .关于Ⅱ类基因基础转录起始复合物在启动子区的装配的研究 ,目前存在两种模型 ,即分步组装模型与RNAPⅡ全酶模型 ,它们分别是基于体外重建转录实验的结果以及酵母中RNAPⅡ全酶巨酶体系的发现而提出的 .在转录激活的分子机制上目前认为存在两个相互联系的过程 ,即解抑制作用和真正的激活作用 .

CⅡTA基因在5种人类细胞系中的表达及意义

本研究探讨5种细胞株中MHC-Ⅱ类抗原(HLA-DR、DP、DQ)表达及IFN-γ诱导后MHC分子与CⅡTA表达的关系。采用Western blot、免疫组织化学和流式细胞术检测5种细胞株中CⅡTA蛋白及MHC分子的表达,用RT-PCR检测细胞株中CⅡTA基因表达。结果表明:5种细胞株中MHC-Ⅱ类分子与CⅡTA的表达一致;组成型表达CⅡTA的细胞株亦表达MHC-Ⅱ类分子,经IFN-γ诱导后表达CⅡTA的细胞株表达MHC-Ⅱ类分子亦恢复;IFN-γ诱导后仍不表达CⅡTA的细胞株,对IFN-γ促MHC-Ⅱ类分子表达的作用亦无反应。结论:某些肿瘤细胞株不能表达MHC-Ⅱ分子与CⅡTA表达缺陷有关,这表明CⅡTA参与调控细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达,它可能在肿瘤免疫逃逸中起一定作用。

MHCⅡ类分子转录激活因子锤头状核酶的生物学活性

目的探讨MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)锤头状核酶抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达。方法设计并克隆针对CⅡTA第464位点的锤头状核酶(Rz464)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM-T载体,进行细胞外切割活性鉴定,进一步将Rz464亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP(pIRES2-EGFP-Rz464,pRz464),并稳定转染Raji细胞株,流式细胞术检测经典的MHCⅡ(HLA-DR-、DP-、DQ)类抗原表达,RT-PCR分析CⅡTA mRNA水平。结果细胞外活性鉴定表明,Rz464具有明显的切割活性。细胞内切割实验显示:pRz464阳性Raji细胞表面HLA-DR、DP、DQ抗原表达分别降低了75.93%、64.14%、78.32%;同时CⅡTA的mRNA含量降低(P<0.05)。结论抗CⅡTA锤头状核酶Rz464可有效抑制MHCⅡ类抗原的表达。

吗啡对胶质瘤C6细胞RNA聚合酶Ⅱ通用转录因子F基因表达的影响

目的 :检测吗啡对 C6胶质瘤细胞 RNA合成的影响。方法 :通过 RT- PCR方法检测吗啡影响 C6胶质瘤细胞 RNA聚合酶 通用转录因子 F (TF F)基因表达的变化。结果 :吗啡作用于 C6胶质瘤细胞与相应对照组相比 ,TF F转录产物均明显减少 ;纳络酮能阻断吗啡对 TF F基因表达抑制的作用。结论 :吗啡通过μ受体途径介导 C6胶质瘤 TF

MHC-Ⅱ基因反义RNA导入脐血CD34^+细胞抑制HLA-DR抗原的表达(英文)

将HLA-DRBI基因cDNA片段反向插入逆转录病毒质粒pZIP-neo SV(x)BamHI位点中,构建了HLA-DRB1基因的逆转录病毒反义RNA重组表达载体,用脂质体法导入PA317细胞。用免疫磁珠法分离、富集脐血CD34^+细胞。将培养的病毒上清感染脐血CD34^+细胞,筛选获得抗性克隆和进行CFU-GM的培养。用RT-PCR法从经G418选择产生的抗性克隆已证实有反义RNA目的基因的表达。流式细胞仪(FACS)检测转染的脐血细胞中HLA-DR抗原阳性率为28％(对照组为45％),其抑制率为38.2％。结果表明导入脐血细胞的MHC-Ⅱ类基因反义RNA重组体可降低其HLA-DR抗原的表达。本实验结果为用反义核酸技术在临床脐血移植中防止移植物抗宿主反应提供了新方法。

抗CⅡTA核糖核酸酶P抑制Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类抗原的表达

探讨抗MHC-Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)的核糖核酸酶P对Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达的抑制作用.M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位.以pTK117质粒为模板,PCR扩增带有抗CⅡTA第452及629位点的引导序列的M1-RNA(M1-452-GS及M1-629-GS),再分别插入pUC19载体(pUC19-M1-452-GS和pUC19-M1-629-GS).从Raji细胞中克隆CⅡTA基因DNA片段(114～800)后插入pGEM-7zf(+)质粒.将重组M1-RNA与靶基因的mRNA进行细胞外共孵育,显示仅pUC19-M1-629-GS可特异性地切割靶基因mRNA.再将M1-629-GS克隆入psNAV载体(pA629)并稳定转染Daudi细胞株,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平,流式细胞术检测其HLA-DR、DP、DQ抗原表达.与对照组比较,M1-629-GS阳性Daudi细胞的CⅡTAmRNA含量减少90.19%(P<0·05),其HLA-DR、DP、DQ抗原表达分别降低91.97%、90.19%、92.36%(P<0·05).研究表明,抗CⅡTA的核糖核酸酶P可通过抑制CⅡTA的转录而降低Daudi细胞表面的MHC-Ⅱ类分子的表达.

MHC Ⅱ类基因表达调控研究进展

目前认为ＭＨＣⅡ类基因的调节主要在转录水平上。已发现一系列作用于其启动子的转录因子，这些转录因子与染色体组蛋白及启动子保守序列交互作用影响ＭＨＣⅡ类基因的表达。其中，顺式作用元件与反式作用因子协同形成的蛋白—蛋白复合体起关键作用。本文对近年来在ＭＨＣⅡ类基因表达研究的长足进展作一综述。

Ⅱ类主要组织相容性复合物转录激活子多态性与冠心病的相关性研究

目的研究Ⅱ类主要组织相容性复合物转录激活子(MHC2TA)-168A→G多态性在中国汉族人群中的分布及与冠心病的相关性。方法采用错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术,对158例冠心病患者及167例正常人群MHC2TA-168A→G多态性进行研究。结果研究人群中存在MHC2TA-168A→G多态性;检测AA、AG和GG基因型频率在冠心病组中分别为52.53%、39.24%、8.23%,正常对照组频率分别为65.87%、28.14%、5.99%,基因型分布存在差异,具有统计学意义(P<0.05);冠心病组G等位基频率(30.10%)明显高于对照组(20.06%)(OR:1.751,95%CI:1.070～2.221,P<0.05)。结论 MHC2TA-168A→G多态性与冠心病遗传易感性相关,其中G等位基因增加了患冠心病的危险性。

Ⅱ类主要组织相容性复合物转录激活子(MHC2TA)-168A→G多态性与冠心病的相关性研究

目的研究Ⅱ类主要组织相容性复合物转录激活子(MHC2TA)-168A→G多态性在中国汉族人群中的分布及与冠心病的相关性。方法采用错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(mpPCR-RFLP),对汉族185例冠心病患者及149名正常人群MHC2TA基因-168A→G位点进行研究。结果冠心病组与对照组均检出-168AA、-168AG和-168GG基因型,MHC2TA-168A等位基因频率分别为0.724和0.802,MHC2TA-168G等位基因频率分别为0.276和0.198,冠心病组MHC2TA-168G基因型频率(0.276)明显高于对照组(0.198。OR:1.542,95%CI:1.070～2.221;P<0.05。结论MHC2TA-168A→G多态性与冠心病有关,G等位基因可能是汉族人群冠心病的遗传危险因素。

Ⅱ类分子反式激活因子与MHC表达

MHC Ⅱ类分子反式激活因子 (CⅡTA)是参与MHC Ⅱ类基因转录的关键调节蛋白 ,它的调节基本上决定了MHC Ⅱ类分子的存在与否及表达程度 ,也决定了免疫应答的本质 ,因而被看作是MHC Ⅱ类基因表达的主宰调节者。

CⅡTA基因的应用研究进展

人 MHC-Ⅱ类分子反式激活因子（MHC classⅡtransactivator, CⅡTA）基因全长4,543bp,含有一个3,390bp长的开放读码框,编码一个含1,130个氨基酸的蛋白（分子量为123.5kDa）。它的表达水平直接影响着MHC-Ⅱ分子的表达量,是后者表达的主要调控因子,此外,它还参与激活MHC-Ⅰ类基因和多种抗原递呈相关基因［1,2］。本文就CⅡTA的主要应用研究进展进行综述。

主要组织相容性复合体Ⅱ类分子反式激活因子的研究进展

主要组织相容性复合体Ⅱ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ transactivator,CⅡTA)是 1993年发现的反式转录激活因子,被认为是MHCⅡ类分子表达的主要调控因子。本文就C Ⅱ TA的结构、功能以及对MHC基因调节及其应用前景作一综述。

MHC基因反义RNA导入造血干/祖细胞的研究

目的：将ＨＬＡＤＲＢ１基因ｃＤＮＡ片段反向插入逆转录病毒质粒ＺＩＰｎｅｏＳＶ（×）ＢａｍＨＩ位点中，构建了ＨＬＡＤＲＢ１基因的逆转录病毒反义ＲＮＡ重组表达载体，用脂质体法导入ＰＡ３１７细胞。方法：用免疫磁珠法分离，富集ＣＤ３４＋脐血造血干／祖细胞。含编码人ＨＬＡＤＲＢ１基因的ｐｃＤＶ１质粒，用ＢａｍＨＩ酶解，回收ＨＬＡＤＲＢ１ｃＤＮＡ片段，将ｃＤＮＡ片段反向插入ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（×）逆转录病毒载体，经扩增、抽提、酶切鉴定，用脂质体将反义ＲＮＡ重组体导入到ＰＡ３１７细胞，用含Ｇ４１８３００μｇ／ｍｌ培养液筛选，获抗性克隆，流式细胞仪检测ＨＬＡＤＲ抗原阳性细胞数。结果：重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，其病毒滴度达１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，脐血造血干／祖细胞经免疫磁珠富集后，ＣＤ３４＋细胞高达８５．０％～９０．０％，导入反义ＲＮＡ的脐血干细胞，其ＨＬＡＤＲ抗原表达从导入前的４５．０％降至２８．０％，抑制率达３８２％，而导入空载体后从５６．０％降至４５．０％，差异不显著。结论：ＨＬＡＤＲ的反义ＲＮＡ能导入脐血干细胞。

脐血CD34＋细胞中CⅡTA基因对MHC-Ⅱ类分子表达的调控

MHC-Ⅱ类分子缺失可导致致命性的免疫缺陷。研究表明，多数急性早幼粒细胞白血病患者中白血病细胞不表达MHC-Ⅱ类分子，该白血病细胞不能够将抗原呈递给辅助性T细胞，从而影响细胞毒性T细胞的活化，最终导致肿瘤细胞逃避机体的免疫监视作用。MHC—Ⅱ类分子转录激活因子（MHC classⅡ transactivator，CⅡTA）可调控MHC-Ⅱ类分子表达。通过CⅡTA基因敲除小鼠证实，CⅡTA对MHC-Ⅱ类分子表达具有调控作用，故CⅡTA成为恢复MHC-Ⅱ类分子表达并发挥抗肿瘤作用的免疫治疗位点。我们通过CⅡTAsiRNA转染脐血CD34＋细胞，观察siRNA对CⅡTA的沉默效应，进一步证实CⅡTA对MHC-Ⅱ分子的调控作用。

反式转录因子在多器官功能障碍综合征中对MHCⅡ类基因的调控

目的探讨主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类基因的反式转录因子(CⅡTA)在多器官功能障碍综合征(MODS)中对MHCⅡ类基因的调控机理。方法 18只雄性家猪随机分为实验组(n=9)和对照组(n=9)。实验组给予失血性休克、再灌注损伤、内毒素血症等复合干扰因素,建立二次打击猪MODS模型;对照组仅进行麻醉和动静脉插管。7d后处死存活动物。切取实验组造模成功动物和对照组动物的脾脏组织,用Trizol法提取总RNA。设计CⅡTA和猪MHCⅡ类基因(SLA-DQA)引物序列,逆转录构建cDNA,行实时荧光定量PCR检测。UVP计算机图像分析系统绘出标准曲线并得出2组CⅡTA mRNA和SLA-DQA mRNA的拷贝数。以Pearson法分析MODS动物CⅡTA mRNA和SLA-DQA mRNA表达的相关性。结果实验组动物死亡7例,有8例发生MODS。对照组动物CⅡTA mRNA的拷贝数为(3.516±1.237)×103,实验组MODS动物为(0.367±0.088)×103,差异有统计学意义(P=0.000);对照组SLA-DQA mRNA拷贝数为(5.330±3.053)×103,实验组为(1.376±1.006)×103,差异亦有统计学意义(P=0.002)。MODS动物中CⅡTA mRNA和SLA-DQA mRNA的表达呈正相关(Pearson值为0.499,P=0.017)。结论 MODS模型复制满意。MHCⅡ类基因在MODS中表达下降与CⅡTA的调控有关。

应用RNA干扰阻抑小鼠L929细胞MHCⅡ类基因表达及功能的研究

为了探讨RNA干扰技术对小鼠CⅡTA(II类反式激活因子)以及MHC Ⅱ类基因表达和功能的影响。我们首先设计并合成4条小干扰RNA(small-interfering RNA,siRNA)(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4)序列,在阳离子脂质体的介导下转染小鼠L929细胞。48h后,用半定量RT-PCR和定量PCR方法检测CⅡTA mRNA的变化;流式细胞仪检测I-Ab分子表达的变化。接着构建了CIITA特异的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,通过在靶细胞内转录形成具有特异干扰作用的shRNA,高效、特异的阻断CⅡTA基因的表达,形成Ⅱ类基因功能缺陷或使其表达降低。进一步混合淋巴细胞反应观察同种异基因CD4+T细胞对稳定转入RAN干扰载体的L929细胞的免疫应答强度,结果证实该L929细胞对不同受者CD4+T细胞的刺激能力分别下降73.90%和76.34%。以上结果为减低同种异体/异种器官细胞性排斥提供了新的思路和手段。