EGFR基因knockdown对肝癌细胞MHCC-97H侵袭迁移能力的影响

目的探讨RNA干扰表皮生长因子受体(EGFR)基因对肝癌细胞株MHCC-97H侵袭和迁移能力的影响。方法构建EGFR基因shRNA,使用Lipofectamine 2000转染MHCC-97H细胞,Real-time PCR和Western blot检测EGFR和pEGFR的表达;细胞划痕、Transwell检测MHCC-97H细胞侵袭和迁移能力的变化。结果与正常组相比,转染EGFR shRNA组EGFR和p-EGFR均显著降低(P<0.05);同时,细胞的侵袭、迁移能力均明显减弱(P<0.05)。结论干扰EGFR可降低MHCC-97H细胞侵袭、迁移能力,降低其远处转移能力。

抑制UHRF1基因表达对肝癌细胞MHCC-97H迁移的影响及相关机制

目的探讨通过RNA干扰抑制泛素样含PHD和环指域1(UHRF1)基因表达对肝癌MHCC-97H细胞迁移的影响及可能机制。方法合成UHRF1基因特异性小发夹RNA(shRNA),构建稳定干扰UHRF1基因表达的重组慢病毒LV-sh UHRF1(以空载体慢病毒LV-sh NC作为阴性对照),并将其感染MHCC-97H细胞。实时荧光定量PCR法检测UHRF1 mRNA在MHCC-97H细胞中表达情况,蛋白质印迹法检测UHRF1、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况,Transwell法检测MHCC-97H细胞迁移能力。结果 LV-sh UHRF1组UHRF1mRNA和蛋白表达量及MMP-9、VEGF蛋白表达量均明显低于LV-sh NC组(P均<0.05),迁移细胞数明显少于LV-sh NC组(P<0.05)。结论通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制UHRF1的表达后可抑制MHCC-97H细胞的迁移能力,机制可能与影响MMP-9和VEGF的表达有关。

过表达maspin基因对肝癌细胞株MHCC-97中VEGF,uPA表达的影响

目的:探讨过表达maspin基因对肝癌细胞株MHCC-97中VEGF和uPA表达的影响及意义.方法:构建maspin/pEFIRES-N表达质粒,重组质粒转染后,采用RT-PCR及Western Blot方法分别从mRNA和蛋白水平检测肝癌细胞株MHCC-97中maspin,VEGF和uPA转染前后的表达.结果:成功构建maspin/pEFIRES-N重组质粒,并稳定转染到肝癌细胞株MHCC-97中.比较maspin/pEFIRES-N组和pEFIRES-N组的肝癌细胞株MHCC-97中maspin,VEGF和uPA的表达,结果显示转染maspin基因后在肝癌细胞株MHCC-97中maspin的mRNA和蛋白表达明显增强,而VEGF,uPA的mRNA和蛋白表达明显减弱(P<0.05).结论:在肝癌细胞株MHCC-97中,maspin基因的过表达会降低VEGF和uPA的mRNA及蛋白表达,从而可能抑制新生血管形成、阻断纤溶酶原激活物调节uPA的活性,减少ECM的降解,阻止肿瘤细胞的转移.

抑癌基因maspin在肝癌细胞株MHCC-97中对VEGF的生物学作用

目的:探讨抑癌基因maspin在肝癌细胞株MHCC-97中对血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的生物学作用及意义。方法:构建maspin/pEFIRES-N表达质粒,重组质粒转染后,采用RT-PCR及WesternBlot方法分别从mRNA和蛋白水平检测肝癌细胞株MHCC-97中maspin和VEGF转染前后的表达。结果:成功构建maspin/pEFIRES-N重组质粒,并稳定转染到肝癌细胞株MHCC-97中,显示转染maspin基因后在肝癌细胞株MHCC-97中maspin的mRNA和蛋白表达明显增强,而VEGF的mRNA和蛋白表达明显减弱(P<0.05)。结论:在肝癌细胞株MHCC-97中,maspin基因的过表达会降低VEGF的mRNA及蛋白表达,从而可能抑制新生血管形成,阻止肿瘤细胞的增生和转移。

苍术酮对人肝癌细胞MHCC97-H增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及机制研究

目的探讨苍术酮对人肝癌细胞MHCC97-H增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及机制。方法体外培养人肝癌细胞MHCC97-H,采用CCK-8法检测细胞活性,计算苍术酮的半数抑制浓度(IC50)。将MHCC97-H细胞分为对照组和苍术酮5、10、20μmol·L^(-1)浓度组,分别干预24 h。采用克隆形成实验(培养2周)检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;Western Blot法检测细胞上皮-间质转化(EMT)及凋亡相关蛋白的表达情况。结果苍术酮干预MHCC97-H细胞24 h的IC50为24.97μmol·L^(-1)。与对照组比较,苍术酮10、20μmol·L^(-1)组的MHCC97-H细胞集落数显著减少(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),MHCC97-H细胞E-钙黏蛋白(E-cad)表达显著上调(P<0.01);苍术酮5、10、20μmol·L^(-1)组的MHCC97-H细胞迁移数及侵袭数均显著减少(P<0.05,P<0.01),MHCC97-H细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cad)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白表达显著下调(P<0.01),金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)蛋白表达显著上调(P<0.05,P<0.01)。结论苍术酮能够抑制人肝癌细胞MHCC97-H增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡,可能与调控细胞EMT及凋亡相关蛋白表达有关。

FBXW7/MCM7信号轴介导肝癌细胞增殖的研究

目的 探讨FBXW7靶向调控MCM7表达对肝癌细胞增殖的影响。方法 采用免疫共沉淀法(CoIP)和免疫荧光染色法(IF),分析肝癌细胞系MHCC-97H中FBXW7与MCM7的互作关系;通过慢病毒感染过表达FBXW7和(或) MCM7,小干扰RNA技术下调FBXW7和(或) MCM7的表达;采用Western blot检测FBXW7对MCM7蛋白表达的影响,CCK-8实验检测肝癌细胞的增殖活性,EdU细胞增殖检测分析肝癌细胞的增殖能力,平板克隆实验分析肝癌细胞的集落形成能力。结果 在MHCC-97H细胞中,FBXW7与MCM7存在互作关系:过表达FBXW7抑制了MCM7的蛋白表达水平、并抑制了肝癌MHCC-97H细胞的增殖(P <0.05),在过表达FBXW7的基础上增加MCM7的表达后,细胞增殖能力提高(P <0.05);下调FBXW7后细胞中MCM7表达增加、细胞增殖能力增强(P <0.05),而下调FBXW7的同时干扰MCM7表达后,细胞增殖能力减弱(P <0.05)。结论 FBXW7能抑制肝癌细胞增殖,其机制与负向调节肝癌细胞中促癌蛋白MCM7的表达水平有关。

紫花牡荆素通过miR-148a-3p/Wnt1信号通路抑制肝癌MHCC97H细胞的迁移和侵袭

目的用紫花牡荆素(casticin,CAS)处理MHCC97H细胞,观察其迁移和侵袭能力的变化,并初步探讨CAS的分子作用机制。方法CCK-8试剂盒检测不同浓度CAS对MHCC97H细胞活力的影响;分组开展细胞迁移和侵袭实验,评估MHCC97H细胞的迁移和侵袭能力;逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)检测CAS处理后,MHCC97H细胞的miR-148a-3p和Wnt1 mRNA表达变化;迁移侵袭相关蛋白(MMP2、MMP9)和Wnt1蛋白表达量采用Western blot检测;Dual-Luciferase报告基因检测miR-148a-3p与Wnt13′-UTR的结合情况。结果CAS明显抑制MHCC97H细胞的生存活力,其对这种细胞的IC_(50)约为10.0μmol·L^(-1),亚细胞毒浓度的CAS(3.0μmol·L^(-1))可减弱这种细胞的迁移和侵袭能力;miR-148a-3p mimic或CAS均能抑制MHCC97H细胞迁移和侵袭能力,且两者联合处理后的抑制作用强于单独使用;过表达Wnt1能有效减弱CAS的抑制作用;CAS能明显上调MHCC97H细胞miR-148a-3p表达,同时Wnt1、MMP2和MMP9的表达呈现下降;Dual-Luciferase报告基因发现,miR-148a-3p可以直接靶向Wnt13′-UTR。结论CAS可通过miR-148a-3p/Wnt1信号通路减弱肝癌细胞的迁移和侵袭。

缺氧对人肝癌细胞MHCC-97L迁移的影响

目的:研究缺氧对人肝癌细胞MHCC-97L迁移的影响,并初步揭示其分子机制。方法:建立划痕实验检测缺氧条件下人肝癌细胞MHCC-97L迁移能力变化的可靠模型,研究Wnt5a对MHCC-97L细胞迁移的调控。结果:缺氧使MHCC-97L细胞缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和Wnt5a mRNA表达上调,并可促进MHCC-97L细胞迁移能力显著增强,干扰HIF-1α表达的MHCC-97L细胞在缺氧条件下Wnt5a mRNA表达显著降低,干扰Wnt5a表达的MHCC-97L细胞在缺氧环境中的迁移能力则明显降低。结论:在缺氧条件下MHCC-97L细胞迁移能力可发生明显改变,HIF-1α和Wnt5a调控其迁移过程。这些结果为深入阐明肝癌细胞转移和侵袭分子调控机制提供了新的实验线索。

microRNA-7对人肝癌细胞MHCC-97H上皮间质转化的影响及作用机制

目的探讨microRNA-7(miR-7)对肝癌细胞株MHCC-97H上皮-间质转化(EMT)的影响及作用机制。方法将构建的miR-7真核载体单独及分别联合野生型或突变型EGFR 3’-UTR真核载体共转染MHCC-97H细胞,采用Realtime PCR、Western blot检测EMT标识蛋白E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin的表达;细胞划痕、Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力的变化;双荧光素酶实验分析miR-7对EGFR的调控作用。结果与正常组相比,转染miR-7真核载体组细胞E-cadherin、β-catenin表达均显著升高(P<0.01),N-cadherin、Vimentin表达则明显降低(P<0.01);同时,细胞的侵袭、迁移能力均明显减弱(P<0.01);分别与转染GV272+EGFR 3’-UTR野生型和转染GV272/miR-7+EGFR 3’-UTR突变型相比,转染GV272/miR-7+EGFR 3’-UTR野生型组萤火虫荧光素酶活性显著降低(P<0.01)。结论 miR-7可通过与EGFR 3’-UTR结合而抑制EGFR信号通路,降低MHCC-97H细胞侵袭、迁移能力,进而抑制MHCC-97H细胞EMT。

KAI1基因对MHCC97-H肝癌细胞粘附力的影响

目的探讨KAI1基因对MHCC97-H肝癌细胞粘附力的影响,从而推测KAI1基因影响MHCC97-H肝癌细胞侵袭转移的机制。方法采用微管吸吮技术研究我们前已转染人类KAI1全长正、反义结构基因的人肝癌MHCC97-H细胞粘附力。结果在纤维连接蛋白(fibronectin,FN)裱衬表面,利用微管吸吮系统测得的各组肝癌细胞的粘附力分别为MHCC97-H-S组(678·4±101·8),MHCC97-H-AS组(1083·6±113·8),MHCC97-H-pCI组(853·0±105·4)及MHCC97-H亲本细胞组(834·6±130·5)(单位为10-10N,细胞数为25)。与MHCC97-H亲本细胞组比较,MHCC97-H-S组细胞对FN的粘附力显著下降(P<0·01),MHCC97-H-AS组细胞对FN的粘附力显著增加(P<0·01),而MHCC97-H-pCI组细胞对FN的粘附力无明显变化(P>0·05)。结论KAI1基因可能降低肝癌细胞对细胞外基质FN的粘附力,从而抑制转移的初始步骤,进而抑制MHCC97-H肝癌细胞的侵袭和转移。

穿心莲内酯对人肝癌细胞MHCC97H增殖的影响及其机制研究

【目的】观察穿心莲内酯(Andro)对人肝癌细胞MHCC97H增殖的影响及作用机制,探讨其体外抗肝癌作用。【方法】采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Andro不同浓度(5、10、20、30、40、50μmol/L)及不同处理时间(24、48、72 h)对MHCC97H细胞增殖的影响;采用Annexin V—碘化丙啶(PI)双染法、Hoechst 33342染色法观察细胞凋亡;采用流式细胞术检测细胞周期分布;采用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测凋亡相关蛋白如Bax、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、裂解型胱天蛋白酶3(cleaved-caspase-3)、剪切型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved-PAPR),周期相关蛋白如周期素B1(cyclin B1)、周期素依赖性激酶1(CDK1)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白如m TOR、p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)的表达。【结果】穿心莲内酯5、10、20、30、40、50μmol/L组24、48、72 h MHCC97H细胞增殖率下降,且随着Andro浓度、处理时间的增加而逐渐降低。Andro 25、50μmol/L组12、24、48 h MHCC97H细胞凋亡率均升高,呈浓度和时间依赖性。Andro 50μmol/L组48 h MHCC97H细胞发生G2/M期阻滞。与溶剂对照组比较,Andro 50μmol/L组中促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表达升高(P<0.05或P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P<0.01),周期蛋白cyclin B1和CDK1表达及mTOR信号通路蛋白mTOR、p70S6K的磷酸化水平均下降(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。【结论】Andro可能通过调控MHCC97H细胞凋亡相关蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bcl-2及周期相关蛋白cyclin B1、CDK1的表达及抑制mTOR-p70S6K信号通路的激活,促进细胞凋亡及细胞周期阻滞,从而发挥体外抗肝癌作用。

益气化瘀解毒方对人肝癌细胞MHCC97-H迁移能力及趋化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7表达的影响

目的观察益气化瘀解毒方对人肝癌细胞MHCC97-H迁移能力及趋化因子CXCL12、CXCR4、CXCR7表达的影响,探讨其相关作用机制。方法以索拉非尼为阳性对照,CCK-8法测定益气化瘀解毒方及索拉非尼对MHCC97-H细胞增殖的作用及最佳作用浓度,划痕实验观察MHCC97-H细胞迁移能力;Western blot检测药物干预24 h后CXCL12、CXCR4、CXCR7的蛋白表达。结果益气化瘀解毒方及索拉非尼均能抑制MHCC97-H细胞生长,24 h半数抑制浓度分别为0.095 g/m L、10μmol/m L;益气化瘀解毒方及索拉非尼均有抑制MHCC97-H迁移的能力;经益气化瘀解毒方干预后,MHCC9-H细胞CXCL12、CXCR4、CXCR7蛋白表达量均下降。结论益气化瘀解毒方能抑制MHCC97-H细胞增殖及迁移,其机制可能是通过下调CXCL12/CXCR4/CXCR7趋化因子轴发挥作用。

KHI1正反义基因对MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响

目的:构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,了解其对高转移潜能的MHCC97—H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响.方法:利用亚克隆技术构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,并用脂质体法将其分别转入高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞系,通过免疫细胞化学SP法检测KAI1蛋白表达情况。结果:限制性内切酶分析证明两个重组子的结构均与KAI1正、反义基因表达质粒的预期结构一致。免疫细胞化学SP法检测显示,转入正义KAI1基因后的肝癌细胞KAI1蛋白染色加深,(细胞积分光密度 integra oculus dehter,IOD20.127 ± 5.099 vs 12.675±1.921,P<0.01);而转入反义KAI1基因的肝癌细胞则KAI1蛋白染色变浅,(IOD 8.681±2.472 vs 12.675 ± 1.921,P<0.01).结论:成功构建了KAIl基因正、反义真核表达质粒.KAI1正义基因能上调肝癌细胞KAI1蛋白的表达,相反,KAI1反义基因则能下调肝癌细胞KAI1蛋白的表达.

转录共激活子TAZ对肝癌细胞株MHCC97H增殖能力的影响

目的观察转录共激活子TAZ对肝癌细胞株MHCC97H的增殖能力的影响,以期对阐明原发性肝细胞癌(HCC)的发生发展机制提供1个新的研究思路。方法应用细胞转染、RNA干扰(RNAi)以及过表达技术,在肝癌细胞株MHCC97H中干预TAZ的表达。在转染后提取细胞RNA和总蛋白,应用qRT-PCR和Western blot等方法检测TAZ、Nek7的表达。选用细胞计数kit-8(CCK-8)法检测细胞活性和增殖能力。结果与NC组相比,转染了TAZ特异性靶向干扰片段之后,TAZ的mRNA与蛋白表达水平均出现下调,差异具有统计学意义(P<0.0001);Nek7表达也出现下降,差异具有统计学意义(P<0.0001);功能实验(CKK8)发现MHCC97H细胞活性和增殖能力也降低,差异具有统计学意义(P<0.001)。另一方面,过表达了TAZ之后,Nek7表达水平也相应上调了,差异具有统计学意义(P<0.0001);MHCC97H细胞活性和增殖能力也提高,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论转录共激活子TAZ能通过调控Nek7的表达对肝癌细胞MHCC97H的增殖能力产生影响,该发现对于阐明TAZ在肝癌发生发展过程中的作用提供一定的实验基础。

TGF-β1通过EMT促进肝癌细胞株MHCC97L的转移

目的构建TGF-β1真核表达载体,转染低转移MHCC97L肝癌细胞株,检测该肿瘤细胞的迁移、增殖能力,为阐明TGF-β1在肝癌细胞迁移中的作用奠定基础。方法构建真核表达质粒,转染MHCC97L肝癌细胞株,荧光定量PCR和Western blot检测其上皮-间充质转化(EMT)标志因子的表达,细胞划线和MTT增殖检测细胞的迁移和增殖。结果 MHCC97L-TGF-β1细胞比MHCC97L细胞E-cadherin的表达水平下降,而N-cadherin、Fibronectin和Vimentin的表达水平显著升高;MHCC97L-TGF-β1细胞的迁移能力增强,但细胞的增殖能力下降。结论 TGF-β1在低转移的肿瘤细胞株MHCC97L的表达,增强了细胞的迁移能力,为进一步体外和动物实验奠定了基础,也为肝癌转移的临床治疗提供了借鉴。

肿瘤转移抑制基因KAI1对MHCC97-H肝癌细胞粘弹性的影响

目的:探讨肿瘤转移抑制基因KAI1对高转移潜能肝癌细胞MHCC97-H粘弹性的影响. 方法:采用微管吸吮技术研究我们前已转染人类KAI1全长正或反义结构基因的人肝癌MHCC97-H细胞粘弹特性. 结果:MHCC97-H肝癌细胞的粘弹性系数K1,K2,μ在转染KAI1正义基因后明显增加(P=0.007),在转染KAI1 反义基因后明显降低(P=0.000),而转染空载体后则无明显变化(P=0.444). 结论:KAl1基因对肝癌细胞的粘弹性有明显影响,这为肝癌侵袭和转移机制的研究提供了重要线索.

GPC3对肝癌细胞株MHCC97-L增殖的影响

目的通过构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,研究GPC3对人肝癌细胞株MHCC97-L增殖的影响。方法用基因重组及限制性内切酶技术构建并鉴定表达载体pEGFP-c3-GPC3,通过脂质体介导转染人肝癌细胞株MHCC-97L,流式细胞术和G418筛选建立稳定细胞株;采用荧光定量PCR、Western blotting分别检测MHCC-97L中GPC3 mRNA和蛋白的表达情况,并在荧光显微镜下观察细胞荧光;MTT法检测GPC3对肝癌细胞MHCC97-L体外增殖能力的影响。结果经酶切及测序鉴定,确认成功构建真核表达载体pEGFP-c3-GPC3,荧光显微镜下观察到绿色荧光表达;从mRNA和蛋白水平证实,GPC3基因在转染后的MHCC-97L中成功表达;MTT生长曲线证实MHCC97-L/GPC3较其他两株细胞增殖显著加强(P<0.001)。结论成功构建pEGFR-c3-GPC3真核表达载体;筛选出稳定表达GPC3基因的MHCC97-L/GPC3细胞株;GPC3基因表达升高可促进肝癌细胞株MHCC97-L的增殖。

大蒜素抑制肝癌MHCC97H细胞的迁移、侵袭

目的:观察大蒜素对肝癌MHCC97H细胞株体外增殖、迁移、侵袭及对MMP-2、MMP-9、CD24 mRNA表达的影响并初步探讨其机制.方法:以肝癌MHCC97H细胞株为研究对象,MTT法、Transwell小室实验检测不同浓度大蒜素对肝癌MHCC97H细胞株迁移、侵袭能力的影响.实时定量PCR检测(realtime quantitative PCR,qRT-PCR)法检测不同浓度大蒜素对MHCC97H细胞株MMP-2、MMP-9、CD24 mRNA表达的影响.结果:MTT显示大蒜素抑制MHCC97H细胞增殖(P<0.01),呈现剂量依赖性.Transwell小室实验显示大蒜素抑制MHCC97H细胞的迁移(P<0.01),一定范围内呈现剂量依赖性,大蒜素组侵袭细胞较阴性对照组显著减少(P<0.01).qRT-PCR检测发现不同浓度大蒜素可以下调MHCC97H细胞MMP-2、MMP-9、CD24的表达,且呈现一定程度剂量依赖性(P<0.01).结论:大蒜素对肝癌MHCC97H细胞株的增殖、迁移、侵袭有抑制作用,且在一定范围内呈现出剂量依赖性.其机制可能与抑制其MMP-2、MMP-9、CD24 mRAN的表达有关.

肝癌MHCC97H细胞中CD133^+和CD133^-亚群分选及其生物学特性

目的分选肝癌MHCC97H细胞中的CD133+和CD133-细胞亚群,并初步探讨CD133+细胞亚群的干细胞特性。方法用磁珠分选技术分选MHCC97H细胞株中的CD133+和CD133-细胞亚群,用流式细胞仪检测分选前后CD133的表达,用MTT法检测其增殖能力,比较其体内成瘤能力,用Western印迹法检测其干细胞相关基因蛋白的表达。结果分选前后MHCC97H细胞中CD133表达分别为(1.09±0.43)vs(86.65±6.49)%(P<0.01)。与CD133-亚群相比,CD133+亚群的体外增殖能力较强,成瘤能力高,高表达干细胞相关基因蛋白(P<0.05,P<0.01)。结论肝癌细胞株MHCC97H中的CD133+细胞亚群具有肿瘤干细胞的特性;CD133是人肝癌MHCC97H细胞株的肿瘤干细胞的表型之一。