MHCI类抗原多肽致敏IL-2基因修饰的树突状细胞对小鼠引流淋巴结T细胞亚群的影响及其免疫保护作用

目的 :探讨MHCI类分子限制性肿瘤抗原多肽Mutl体外冲击白细胞介素 2 (Interleukin 2 ,IL 2 )基因修饰的树突状细胞 (Dendrticcells,DC)对小鼠体内特异性免疫的活化机制。方法 :用腺病毒作为载体介导小鼠IL 2基因修饰DC ,用小鼠Lewis肺癌 3LL细胞株MHCI类分子限制性八肽Mutl冲击IL 2基因修饰的DC(DC IL 2 Mutl)免疫小鼠 ,用流式细胞术 (FACS)分析免疫保护小鼠接受 3LL细胞再攻击后引流淋巴结内T细胞亚群的比例变化。结果 :用Mutl冲击的DC免疫的小鼠抵抗3LL细胞再攻击时 ,引流淋巴结内CD8+ T淋巴细胞比例明显升高 ,DC IL 2 Mutl免疫保护的小鼠接受 3LL细胞再攻击后引流淋巴结内CD8+ 和NK细胞的比例都明显升高。结论 :研究表明MHCI类分子限制性肿瘤抗原多肽体外冲击IL 2基因修饰的DC免疫小鼠 ,能诱导小鼠产生特异性抗肿瘤免疫应答 。

重组可溶性MHCI类相关蛋白A对NK细胞生物学活性的影响

目的:研究体外重组可溶性MHCI类相关蛋白A(sMICA)对NK细胞杀伤靶细胞活性、分泌IFN-γ、增殖和凋亡的影响。方法:将重组sMICA蛋白与人外周血NK细胞相互作用过夜后,流式细胞仪检测NK细胞杀伤K562靶细胞的能力;ELISA检测培养上清IFN-γ浓度;MTS/PMS法检测sMICA对NK细胞增殖的影响;给NK细胞标记Annexin V和碘化丙啶检测凋亡情况。结果:可溶性MICA抑制NK细胞杀伤K562细胞的活性,下调IFN-γ的分泌,却对NK细胞的增殖和凋亡没有影响。结论:肿瘤细胞表面脱落的sMICA抗原可通过抑制NK细胞活性而逃逸机体的免疫监视功能。

树突状细胞上调MHCI类相关抗原A表达对NK细胞活性的影响

目的:观察单核细胞、未成熟和成熟树突状细胞(DCs)表达MHCI类相关抗原A(MICA)的情况,以及DCs表达MICA后对NK细胞活性的影响。方法:用流式细胞术分别检测单核细胞、未成熟DC(iDCs)以及LPS、TNF-α、CD40L、IL-15和IFN-α分别刺激的成熟DCs表面MICA的表达,并观察DCs表达MICA后对NK细胞表达CD69、细胞毒活性和分泌IFN-γ的影响。最后用流式细胞术检测重组NKG2D/Fc蛋白和抗IL-12单克隆抗体(mAb)对DCs激活NK细胞的影响。结果:单核细胞不表达MICA,iDCs低表达MI-CA。LPS、TNF-α和CD40L对DCs表达MICA无影响;但IFN-α和IL-15可促进DC上调MICA表达。DCs表达MICA后可促进NK细胞表达CD69、分泌IFN-γ、杀伤K562细胞。NKG2D/Fc蛋白可抑制NK细胞的杀伤活性和分泌IFN-γ;而抗IL-12mAb仅抑制IFN-γ分泌。结论:MICA在DCs表面的表达受局部微环境影响,且DCs表达MICA后可增强NK细胞的活性。

与MHCI类相关的抗原加工和抗原提呈的分子基础

细胞内ＭＨＣＩ类抗原提呈途径十分复杂。本文主要综述参与此过程并位于ＭＨＣ基因群中的几个相关分子。胞浆中蛋白酶体的亚羊位ＬＭＰ２、ＬＭＰ７水解蛋白抗原产生可优先与ＭＨＣＩ类分子结合的多肽。ＴＡＰ１和ＴＡＰ２负责将多肽转位至内质网中。热休克蛋白家族的一系列分子亦参与多肽在胞浆及内质网中的传递。ＩＦＮ－γ对ＭＨＣＩ类分子及上述分子均有上调作用。另外，Ｃａｌｎｅｘｉｎ和Ｂｉｐ等分子亦参与内质网内ＭＨＣＩ类分子的装配。

抗MHC I类单抗对NK细胞杀伤能力的影响

目的：探讨ＮＫ细胞杀伤与靶细胞表面ＭＨＣＩ类分子的关系。方法：用ＨＬＡＡＢＣ单抗培养上清或腹水封闭靶细胞Ｋ５６２表面的ＨＬＡＡＢＣ分子后，分别观察了外周血新鲜ＮＫ细胞、纯化ＮＫ细胞、ＬＡＫ细胞和ＣＤ３ＡＫ细胞对Ｋ５６２细胞杀伤能力的变化。结果：外周血新鲜ＮＫ细胞和纯化ＮＫ细胞对Ｋ５６２的杀伤率明显提高，ＣＤ３ＡＫ细胞的杀伤力明显降低，ＬＡＫ细胞的杀伤无明显变化。结论：ＮＫ细胞通过其表面受体识别靶细胞上的ＭＨＣＩ类分子而传递杀伤抑制性信号，抗ＨＬＡＡＢＣ单抗封闭了靶细胞上的ＨＬＡＡＢＣ等位基因而阻止了阴性信号的传导。

原发性肝癌HSP70和MHC Ⅰ类分子的表达

采用免疫组化法检测11例未经治疗的原发性肝癌(HCC)手术组织标本:MHC I类分子、HSP70的表达。结果发现,肝癌组织细胞MHCI类分子的表达与多数肿瘤细胞不同,其表达呈阳性,不存在MHCI类分子低表达或丢失的情况;与癌旁组织相比,肝癌细胞HSP70胞浆、胞膜表达呈强阳性,推测其原因可能是原位于胞浆的HSP70与MHC I类分子结合后被运输至细胞表面,并由此可能增强肝癌细胞的免疫原性,这将促使我们重新审视HCC疫苗设计的构思和考虑其治疗对策。

我国部分省份(地区)汉族人群HLA-I类基因多态性地区差异分析

目的探讨我国部分省份(地区)汉族人群HLA-I类经典基因座位HLA-A、HLA-B、HLA-Cw位点的群体遗传学特点及其基因频率分布的地区差异。方法选取1014例无关汉族拟行造血干细胞移植治疗患者及其健康家系供者的血液样本,提取基因组DNA后,采用序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)分型技术进行HLA-A、HLA-B、HLA-Cw位点基因分型,分析不同地区汉族人群及不同种族间的基因频率分布特征。基于文献报道的我国不同地区汉族人群及不同种族的HLA-I类基因频率资料,计算种群间遗传距离(D),比较不同地区汉族人群及不同种族间遗传距离差异。结果Hard-Weinberg吻合度检验表明,本研究抽样群体适于进行遗传学统计分析。HLA-A位点共检测出14种基因型,最常见的是A*02(0.330)、A*11(0.240)、A*24(0.155)、A*33(0.075);HLA-B位点共检测出27种基因型,最常见的是B*13(0.134)、B*15(0.143)、B*40(0.133)、B*46(0.102);HLA-Cw位点共检测出13种基因型,最常见的是Cw*01(0.157)、Cw*03(0.247)、Cw*07(0.181)、Cw*08(0.106)。群体汉族与其他人种间HLA-A、HLA-B基因频率差异均有统计学意义(P<0.05);除兰州汉族人群仅同南方汉族、湖南、山东、江苏、台湾汉族人群间HLA-A、HLA-B基因频率差异有统计学意义(P<0.05)外,其余各地区汉族人群间HLA-A、HLA-B基因频率差异均有统计学意义(P<0.05)。各地区汉族人群间平均遗传距离D=0.164,辽宁和北方汉族人群间遗传距离(D=0.064)最小,江苏与湖南汉族人群间遗传距离(D=0.299)最大;不同地区汉族人群间遗传距离普遍小于种族间遗传距离。结论我国不同地区汉族人群HLA-I类基因频率分布存在显著差异,但其差异要明显小于世界不同人种间的分布差异。我国汉族人群所特有的HLA-I类基因频率分布格局资料对区域性疾病的个性化治疗、遗传易感性及疾病防治等研究具有很好的理论及应用价值。

固相MHC Ⅰ类相关抗原A刺激的NK细胞对树突状细胞活性的影响

目的:观察固相MHC I类相关抗原A(iMICA)刺激的NK细胞对树突状细胞(DCs)活性的影响。方法:首先取新鲜分离及受固相MICA刺激的异体NK细胞,或IL-2、及IL-2联合iMICA刺激的自体NK细胞与未成熟DCs(iDCs)按5∶1比例孵育24 h后,用流式细胞术(FCM)分析HLA-DR+或CD86+频率的DCs。然后取自体NK细胞以iMICA刺激后,按1∶5的比例与iDCs孵育24 h后,FCM检测DCs上HLA-DR、CD86的表达。最后在NK细胞与DCs的共培养体系中加入抗IFN-γ抗体,观察DCs上HLA-DR、CD86表达的变化。结果:当NK细胞与iDCs孵育比例为5∶1时,异体新鲜分离的与自体活化的NK细胞均能杀伤iDCs;而iMICA无协同作用。当NK细胞与iDCs孵育的比例为1∶5时,iMICA刺激的NK细胞可促进DCs表达HLA-DR和CD86;而加入抗IFN-γ抗体可抑制NK细胞诱导DCs表面HLA-DR和CD86表达的上调。结论:异体新鲜分离的或自体活化的NK细胞杀伤iDCs时,无需iMICA的刺激;但当NK细胞的数目明显低于iDCs时,iMICA可刺激NK细胞分泌IFN-γ促进DCs成熟。

MHCⅠ类分子呈递抗原的途径与肽疫苗研制的进展

主要组织相容性复合体（ＭＨＣ）Ⅰ类分子主要呈递内源合成抗原，供ＣＤ８＋细胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）识别，抗原呈递转运子（ＴＡＰ）与肽相互作用是特异性抗原肽转运和呈递的关键。外源性抗原通过树突状细胞和巨噬细胞等专职性抗原呈递细胞（ＡＰＣ）加工处理后也可被ＭＨＣⅠ类分子呈递。此替代途径不直接依赖于蛋白酶体或ＴＡＰ的转运作用，是人体内部免疫防御监视机制的理想补充。ＡＰＣ－ＭＨＣⅠ类分子ＣＴＬ应答的深入认识是肽疫苗研制的基础。

NK细胞与K562细胞之间相互免疫编辑作用及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的:探讨NK细胞与K562细胞混合培养前、后其杀伤活性的变化及分子机制。方法:流式细胞仪检测NK细胞与K562细胞混合培养前、后细胞表面相应分子的变化,LDH释放法测定效靶比20∶1时NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果:相互编辑前,K562细胞表面MICA/MICB的表达率为(79.90±0.87)%,NK细胞表面NKG2D、KIR2DL1和KIR3DL1的表达率分别为(98.27±0.67)%、(45.70±1.22)%和(35.60±1.35)%。相互编辑后,K562细胞表面MICA/MICB和NK细胞表面NKG2D的表达率分别为(35.56±1.01)和(34.67±3.88)%,均明显低于编辑前(P=0.000);NK细胞表面KIR2DL1和KIR3DL1的表达率分别为(47.20±1.08)%和(34.03±1.20)%,与编辑前比较差异均无显著性(P>0.05)。效靶比20∶1时,NK细胞对编辑后的K562细胞的杀伤活性为(24.07±0.58)%,编辑后的NK细胞对K562细胞的杀伤活性为(16.95±2.00)%,均明显低于编辑前NK细胞对K562细胞的杀伤活性[(54.03±3.46)%](P=0.000)。结论:NK细胞与K562细胞持续性接触后,双方发生了相互免疫编辑作用;NK细胞的杀伤活性下降,其分子机制是细胞表面相应的配受体发生了变化。

结肠癌组织中MICA和ADAM10的表达及其相关性

目的研究MHC I类相关分子A(MHC classⅠchain-related A,MICA)及ADAM10在结肠癌中的表达及其与临床病理学参数之间的关系,并探讨两者的相关性,为结肠癌细胞表面MICA蛋白脱落机制的研究提供组织学依据。方法应用免疫组织化学方法,采用SP法检测有完整资料的90例结肠癌组织及30例癌旁组织中MICA和ADAM10的表达差异。结果在癌组织和癌旁组织中,MICA蛋白表达阳性率分别为67.8%和7.1%,ADAM10蛋白表达阳性率分别为82.2%和20%,差异均具有显著性(P<0.01),并且与淋巴结转移有关(P<0.05),MICA与ADAM10表达呈负相关性(r=-0.258,P<0.05)。结论 MICA的表达降低与AD-AM10的表达升高,可能共同参与了肿瘤的免疫逃逸及肿瘤的转移;且ADAM10在膜型MICA的脱落机制中发挥重要作用。

可溶性HLA-G1-肽复合物的体外折叠和鉴定

目的合成可溶性HLA-G1-肽复合物。方法利用原核高效表达的可溶性HLA-G1重链和轻链(β2m),在人工合成的HLA-G1限制性九肽(KGPPAALTL)存在的条件下,通过稀释复性折叠成可溶性HLA-G1-肽复合物。利用特异性抗体(W6/32及兔抗人β2m抗体)进行免疫印迹及酶联免疫吸附试验,检测稀释复性的折叠产物。结果折叠复合物含有35%可溶性HLA-G1-肽复合物、5%可溶性HLA-G1重链聚合体及60%复性的β2m3种成分。结论通过原核表达、体外折叠能够获得大量可溶性HLA-G1-肽复合物。

鸡MHCⅠα和β2m的原核表达与多克隆抗体的制备

为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。

影响HBV感染后果的宿主遗传因素

乙型肝炎病毒(HBV)感染可引起不同的临床表现,从对双胞胎研究和分离分析(segregation analysis)结果发现,HBV感染的后果至少部分是由宿主遗传背景决定的,目前已有许多的研究正在试图探讨影响HBV感染后果的人类疾病易感基因。 从遗传学观点看,HBV感染的后果是由许多遗传学和环境学因子综合决定的,一些人类基因可能增加或降低HBV感染的易感性,但是这些易感基因单独一个却不足以起到效果,这就降低了连锁分析(limkage analysis)的能力,并可能解释为什么疾病关联(disease association)

丙戊酸钠对肺癌细胞MICA蛋白表达的影响及其信号转导机制

目的研究丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)作为组蛋白去乙酰酶抑制剂对肺癌A549细胞人类MHCⅠ类分子链相关基因A(human MHC classⅠchain-related A,MICA)蛋白表达的影响,并初步探讨其信号转导机制。方法使用不同浓度的VPA刺激处于对数生长期的肺癌A549细胞,培养24h后使用RT-PCR法检测肺癌A549细胞MICA mRNA水平,Western blot法检测MICA蛋白水平,得出最佳VPA刺激浓度。分别以丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的3条主要通路抑制剂即ERK1/2抑制剂(PD98059)、p38蛋白激酶抑制剂(SB203580)、JNK抑制剂(SP600125)预处理A549细胞,再将VPA依照预定最适浓度分别加入培养24h。使用RTPCR法检测A549细胞MICA mRNA水平,Western blot法检测MICA蛋白水平。使用ELISA法检测上述各组A549细胞培养上清液中分泌型MICA(sMICA)蛋白水平。结果 RT-PCR及Western blot检测结果显示加入VPA后A549细胞中MICA mRNA转录水平、MICA蛋白水平均显著升高(均P<0.05);使用p38蛋白激酶抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂PD98059预处理,均能显著减弱VPA诱导的A549细胞MICA mRNA及蛋白水平的提高(P<0.05);各组细胞培养上清液中sMICA浓度无差异。结论 VPA能增强肺癌A549细胞MICA蛋白的表达,其机制可能与ERK、p38信号通路有关。