建立检测嗜肺军团菌mip基因的PCR-微孔板反向探针杂交法

近年来随着对军团菌基因水平的深入研究和聚合酶链反应（ＰＣＲ）及其相关技术的不断发展，为军团菌检测提供了一个快速、敏感、特异的诊断方法，并已用于环境水和临床标本中的军团菌检测，具有较好的检测效果［１］。但是，要使之成为常规的临床诊断方法，尚需不断完善和...

嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达

目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。

mip基因聚合酶链反应结合地高辛标记探针杂交鉴定嗜肺军团菌

目的对嗜肺军团菌国外参考菌株及国内分离菌株的巨噬细胞感染增强子（ｍｉｐ）基因分析，建立一种快速、敏感、特异的嗜肺军团菌基因检测鉴定方法。方法利用嗜肺军团菌种特异性ＤＮＡ片段ｍｉｐ基因通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，对ＰＣＲ阳性产物进行地高辛标记的ｍｉｐ基因探针杂交，观察其反应结果。并对２６株环境和患者中分离的疑似嗜肺军团菌菌株进行分析。结果所有实验用嗜肺军团菌国外参考菌株及国内分离菌株的ｍｉｐ基因的ＰＣＲ扩增结果都为阳性，探针杂交结果也为阳性，而非嗜肺军团菌及与非军团菌对照菌株的ＰＣＲ扩增结果及探针杂交结果都为阴性，本实验其灵敏度和特异度均为１００％。另外２６株疑似嗜肺军团菌菌株有６株被鉴定为嗜肺军团菌。结论所建立嗜肺军团菌的快速初步鉴定方法具有很高的特异性和敏感性。

广州市公共场所中央空调冷却塔水中军团菌mip基因分型

【目的】研究广州市公共场所中央空调冷却塔水中军团菌的基因特征和优势型别。【方法】采用军团菌巨噬细胞感染力增强因子(Macrophage infectivity potentiator,mip)基因分型方法。提取广州市2008-2010年分离的140株(119株嗜肺,21株非嗜肺)军团菌基因组DNA,针对mip基因进行PCR扩增并测序,将核苷酸序列上传至欧洲军团菌感染工作组(EWGLI)数据库进行比对,得到mip型别,并构建系统发育进化树。【结果】140株军团菌均可扩增出700 bp左右的目的条带。119株嗜肺军团菌分为10个mip型别,L.pneumophila-phil-1为优势型别,占52.9%(63/119);21株非嗜肺军团菌分为6个mip型别,L.feeleii-D3131为优势型别,占47.6%(10/21)。【结论】广州市公共场所中央空调冷却塔水中军团菌具有多样性,mip分型技术可用于军团菌的快速基因分型。

鹦鹉热衣原体Mip基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

目的克隆鹦鹉热衣原体巨噬细胞感染增强蛋白(Microphage infectivity potentiator,Mip)基因,构建原核重组质粒,诱导表达重组蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础。方法提取鹦鹉热衣原体6BC基因组DNA,PCR扩增Mip基因,克隆至p ET-30a(+),构建原核表达载体p ET-30a(+)-Cps Mip。PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导p ET-30a(+)-Cps Mip在E.coli BL21中表达目的蛋白。融合蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中抗Mip抗体的效价。结果 PCR扩增得到大小约为768 bp左右的Mip目的片段;经PCR、酶切及测序鉴定,证明构建的原核重组质粒中插入的片段为Cps Mip基因,测序结果经BLAST分析,与Genbank上登录序列完全一致。经IPTG诱导,重组工程菌表达一相对分子量(Mr)约为34 k D的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清效价为1:128 000。结论成功构建了鹦鹉热衣原体Mip基因原核表达载体,并表达了相应可溶性蛋白,制备了高效价的鼠抗Mip多克隆抗体。

肿瘤相关基因MIP在HeLa细胞中的亚细胞定位及其变化

目的探讨肿瘤相关基因MIP的亚细胞定位情况,以及MIP与其相互作用蛋白FASP1、MafF共转染HeLa细胞后亚细胞定位的变化和共定位情况。方法利用在线蛋白质结构和亚细胞定位分析软件,对MIP可能的蛋白结构和亚细胞定位进行分析预测;结合分析结果,采用荧光蛋白融合表达和激光扫描共焦显微技术,观察比较MIP融合于绿色荧光蛋白(GFP)的N端或C端时在HeLa细胞中的亚细胞定位情况。pDsRed-FASP1、pDsRed-MafF分别单独转染,或者与MIP-GFP共同转染HeLa细胞,观察红色、绿色荧光蛋白的分布,分析比较各蛋白的亚细胞定位、变化及共定位情况。结果单独转染时,MIP主要呈不均匀点状分布于细胞质;GFP融合于MIP蛋白的N端或者C端,其亚细胞定位略有变化,MIP-GFP的不均匀分布更加典型,在胞质中呈点状聚集。DsRed-FASP1单独转染时弥散分布于细胞质;与MIP-GFP共同转染后,MIP与FASP1在细胞内的分布没有大的改变,两者能够共定位于细胞质。DsRed-MafF单独转染时弥散分布于细胞核;而与MafF-GFP共同转染时,两者的亚细胞定位均发生显著改变,此时两者能够共定位于细胞核内核仁区。结论 MIP能够与FASP1、MafF在细胞内不同部位相互作用。MIP在细胞质和细胞核中的定位变化,提示MIP可能作为一个重要的信号分子,在细胞质和细胞核中发挥多重作用。

两个低植酸大豆突变体中肌醇-3-磷酸合成酶MIPS1基因表达特性的研究

肌醇-3-磷酸合成酶(MIPS)基因是植酸合成代谢途径中重要的功能基因。本研究以两个大豆低植酸突变体Gm-lpa-TW-1、Gm-lpa-ZC-2以及其野生型亲本台湾75和浙春3号为材料,分析了MIPS1基因在其根、茎、叶、花和发育种子中转录水平上的表达特性。结果表明:在大豆发育的种子中MIPS1基因的表达表现为由弱到强再逐渐减弱的表达特性,在开花后22d的种子内,基因的表达达到高峰,此后逐渐减弱。突变体Gm-lpa-TW-1和野生型亲本台湾75的根、茎、叶和花中MIPS1基因的表达均较弱,但突变体Gm-lpa-TW-1的表达量略高于野生型亲本。与野生型亲本相比较,在开花后的22d,突变体Gm-lpa-TW-1发育种子中MIPS1基因的表达峰极显著的降低,仅为野生型的25%左右,而且在整个种子发育期间MIPS1基因的表达均较弱。突变体Gm-lpa-ZC-2和浙春3号的根、茎、叶和花中MIPS1基因的表达较弱,突变型和野生型之间没有显著的差异,但在种子发育的各个时期突变体Gm-lpa-ZC-2的表达量显著的高于野生型亲本浙春3号。在两个低植酸突变体发育的种子中MIPS1基因的表达与野生型亲本相比均发生了显著的变化,表明基因突变对MIPS1基因的表达均造成了显著的影响,在Gm-lpa-TW-1中表现为MIPS1基因表达的下调,而Gm-lpa-ZC-2中则表现为上调。

大鼠MIP3基因的电子克隆和特性分析

210 .seq是一个在大鼠心肌缺血预适应中表达上调的表达序列标签 (expressedsequencetag ,EST) ,用GENSCAN预测、Blast(Basiclocalalignmentsearchtool)比对、序列拼接、多序列比对等生物信息学方法克隆了该EST代表的大鼠MIP3基因的cDNA序列。大鼠MIP3基因的开放阅读框为 1332bp ,起始密码子前同一相位存在一个终止密码子 ,起始密码子邻近的序列符合Kozak规则 ;推测编码 4 4 3个氨基酸 ,与小鼠和人的MIP3基因or tholog的同源性很高 ,但是与数据库中其它蛋白质的同源性不高。TMpred分析显示该多肽有一个跨膜区域 ,氨基端位于膜内。Motifscan分析仅发现一个脯氨酸富集区域。

大鼠全脑缺血预处理后脑Mip1基因表达

目的探讨全脑缺血预处理后不同时间点鼠脑皮质、海马Mip1基因的表达及其与脑缺血耐受之间的关系。方法SD大鼠随机分成3组,建立大鼠全脑预缺血及缺血再灌注模型,其中2组通过脑水含量测定和组织学改变观察证实模型复制成功。第3组分为实验组(缺血预处理组)、假手术组,采用Northern杂交法检测Mip1在大鼠海马和前皮质在全脑缺血预处理后的表达情况。结果实验鼠全脑缺血3 min(预处理)后12 h组、24 h组海马和前皮质Mip1表达均高于假手术组。结论大鼠短暂非损伤性3 min缺血再灌注12 h、24 h后脑Mip1表达增高。Mip1表达增高可能是脑缺血耐受保护机制的一部分。

嗜肺军团菌mip/ctxB融合基因体外表达与动物免疫试验的免疫原性研究

PCR扩增嗜肺军团菌mip基因和霍乱弧菌ctxB基因,克隆入载体pcDNA3 1( +),重组子经限制性酶切分析、PCR、序列分析鉴定正确后,命名为pcDNA3 1 mip/ctxB.脂质体法将重组质粒pcDNA3 1 mip、pcDNA3 1 mip/ctxB转染NIH3T3细胞,用免疫荧光法和蛋白质印迹鉴定瞬时表达和稳定表达产物,结果发现:重组质粒成功转入细胞并获得短暂表达,稳定转染细胞分别在 2 4ku和 35ku处检测到阳性杂交信号.将pcDNA3 1 mip、pcDNA3 1 mip/ctxB作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN γ产生水平、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性等体液免疫和细胞免疫反应的指标,评价疫苗的免疫原性.结果发现:各实验组均检测到免疫原性,pcDNA3 1 mip/ctxB免疫组的免疫原性高于pcDNA3 1 mip免疫组,有显著性差异(P <0 0 1).

嗜肺军团菌mip/ctxB融合基因动物免疫试验的免疫保护性研究

目的初步评价mip基因DNA疫苗的免疫保护性.方法将20只6～8周龄、体重25 g左右的BALB/c雌性小鼠,随机分为空白对照组、pcDNA3.1(+)阴性对照组、pcDNA3.1-mip免疫组、pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组4个组.每只小鼠股四头肌肌肉注射进行免疫接种,初次免疫2周后加强免疫1次,加强免疫2周后,小鼠腹腔注射嗜肺军团菌L1菌液进行攻击.攻击28 d后,检测小鼠肺组织培养带菌量和肺组织病理形态学变化.结果 pcDNA3.1-mip免疫组和pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组肺组织培养带菌量少于空白对照组和阴性对照组(ANOVA,P＜0.05).小鼠肺组织肉眼未见明显病理变化,在显微镜下观察肺组织病理切片,发现空白对照组与阴性对照组主要表现为渗出性病变,可见肺泡膈明显增宽,肺毛细血管扩张充血,明显的中性粒细胞浸润,肺泡腔内有渗出物;而应用DNA疫苗的两个免疫组无渗出性病变,pcDNA3.1-mip免疫组肺泡壁和肺间膈轻度增厚,pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组肺泡壁和肺泡膈略微增厚.结论应用mip基因DNA疫苗能诱导小鼠在体内产生一定的免疫保护效应.

大豆MIPS1基因的定位及其低植酸突变性状CAPS标记的开发

【目的】定位大豆肌醇-3-磷酸合成酶基因MIPS1,丰富该基因的遗传信息;开发出该基因的特异性分子标记,用于大豆突变体Gm-lpa-TW-1低植酸(LPA)突变性状的辅助选择。【方法】应用公布的大豆基因组数据库和生物信息学分析确定MIPS1候选染色体,利用分离群体中微卫星标记与LPA性状的共分离,定位突变基因MIPS1;根据MIPS1LPA突变性质和同源基因的序列,开发CAPS分子标记。【结果】大豆中有4个MIPS基因,其中MIPS1被定位在染色体18上,为注释为Glyma18g02210的大豆基因,其DNA起始序列为1364774bp,位于SSR标记Satt570(3162690 bp)和Satt115(10422881 bp)之上,遗传距离分别为5.5和15.2cM;开发了MIPS1特异性共显性CAPS标记,与LPA性状完全共分离。【结论】本文首次确定了MIPS1所在染色体及其位置,丰富了该基因的遗传信息,开发的CAPS标记可用于Gm-lpa-TW-1LPA性状的分子标记辅助选择。

香菇编码线粒体中间肽酶的基因片段的克隆及序列测定

在担子菌中,编码线粒体中间肽酶(mitochondrial intermediate peptidase,MIP)的基因普遍与交配型A因子紧密连锁。通过mip基因来定位和分离交配型A因子将是一种有效的研究食用真菌交配型的途径。本研究通过简并PCR法克隆得到一段531bp的香菇mip基因片段。经序列比对分析,该序列与已知的担子菌的mip基因之间有很高的同源性。

嗜肺军团菌m ip基因真核表达重组质粒构建与表达

目的构建嗜肺军团菌m ip基因的真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip,并研究其在细胞中的表达。方法PCR扩增嗜肺军团菌m ip基因,导入载体pcDNA 3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip。用脂质体法将重组质粒pcDNA 3.1-m ip转染N IH 3T 3细胞,采用免疫荧光法和W estern-b lot分别鉴定pcDNA 3.1-m ip的瞬时表达产物和稳定表达产物。结果在细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA 3.1-m ip成功转入N IH 3T 3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA 3.1-m ip稳定转染的N IH 3T 3细胞,在相对分子质量24×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA 3.1-m ip在细胞内表达出M ip蛋白。空质粒pcDNA 3.1(+)转染的N IH 3T 3细胞未检测到绿色荧光和杂交信号。结论成功构建m ip基因真核表达重组质粒,并在N IH 3T 3细胞中表达出相对分子质量为24×103的M ip蛋白。

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan探针荧光定量PCR方法,用于检测嗜肺军团菌mip基因。方法嗜肺军团菌及其他军团菌DNA模板来自中国疾病预防控制中心呼吸道室,嗜肺军团菌地方株及其他对照株由本中心菌种室供给。利用嗜肺军团菌mip基因保守序列设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量PCR反应条件和反应体系进行优化,并对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性等。结果该方法在检测多株嗜肺军团菌时,均出现阳性信号,而对非嗜肺军团菌和其他细菌则未有阳性扩增结果出现。检测灵敏度达10个拷贝/反应,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2 h左右,可减少常规PCR操作的污染机会。结论TaqMan荧光定量PCR方法可定量检测嗜肺军团菌,具有特异性高、快速、敏感等特点,适于外环境污染源状况的调查及应急事件的快速定量检测。

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测军团菌

目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16SrDNA和rnip基因的特异性序列设计引物和MGB探针，两条探针5’端分别标记FAM和HEX，3’端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系，并对军团菌、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它细菌进行检测，验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该方法所检测菌株中军团茵属结果均为16SrDNA阳性（LP12、LP13除外）；嗜肺军团菌均为mip阳性，非嗜肺军团菌属除L．micdadei外均为阴性；而非军团菌菌株16SrDNA和mip检测结果均为阴性。检测灵敏度达10个拷贝／反应；重复性实验中，变异系数为0．2％～O．6％；从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。结论本文建立的TaqMan-MGB双重探针荧光定量PCR是一种定量检测军团菌的特异、快速、敏感的方法，可区分嗜肺与非嗜肺军团菌属，该方法的建立将有益于今后开展对外环境污染源进行初步卫生学调查与评估，以及应急临床标本的快速定量检测。

嗜肺军团菌荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立嗜肺军团菌mip基因荧光定量PCR检测方法。方法:利用Primer Express软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果:该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达293copies/μl;重复性较好,Ct值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论:该方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。

嗜肺军团菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的:建立针对嗜肺军团菌Mip基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法,并进行自来水和空调冷却水模拟标本的检测评价。方法:根据嗜肺军团菌Mip基因的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立嗜肺军团菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对方法进行灵敏度及特异性评价,并对自来水和空调冷却水模拟标本中的嗜肺军团菌进行检测。结果:建立的方法对嗜肺军团菌的检测具有高度特异性,与3种非嗜肺军团菌和6种其他呼吸道病原均没有交叉反应;基因组DNA的检测灵敏度为1.6 pg/μL,模拟自来水和空调冷却水标本的检测灵敏度为10CFU/mL。结论:建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,适于嗜肺军团菌的日常监测和暴发疫情的应急诊断。

军团菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立一种特异、快速、敏感,同时能区分嗜肺和非嗜肺军团菌的荧光定量PCR方法,用于检测临床和环境样品。方法利用军团菌属特异性23S rRNA基因和嗜肺军团菌种mip基因的保守序列,设计引物和TaqMan探针。提取嗜肺军团菌标准菌株(LP1)DNA,分别构建2个含有目的基因的标准质粒作为阳性模板。优化荧光PCR反应条件和反应体系,对方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。并对环境水样及80份临床痰样进行检测。结果该方法检测灵敏度达10标准质粒拷贝数/反应,具有高度特异性、稳定性。整个过程约需2 h。对35份环境水样进行检测,检出3株嗜肺军团菌和3株非嗜肺军团菌,所有水样经传统分离培养法和普通PCR法检测均显示为阴性。对临床80份随机痰液标本进行检测,2份嗜肺军团菌阳性。结论 TaqMan探针荧光定量PCR双管检测是一种可同时区分嗜肺与非嗜肺军团菌的特异、敏感、稳定的方法,可用于基层医院对环境标本及临床痰样的检测。

嗜肺军团菌mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体的构建及表达

目的选取嗜肺军团菌mip和flaA优势抗原表位基因,构建mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体,并在原核系统中表达,为后续制备嗜肺军团菌蛋白疫苗提供初步的实验基础。方法运用生物信息学方法对Mip和FlaA蛋白的二级结构和表面特性如理化性质、亲水性、可塑性、抗原指数以及胞外区等方面进行分析,选择其活性表位可能存在的区域为优势抗原表位区。通过PCR扩增和T4连接酶构建pET-mip、pET-flaA和pET-mip/flaA优势抗原表位基因融合表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。结果 Mip和FlaA都存在多个潜在的抗原表位位点,选取其优势抗原表位区域进行克隆和表达获得成功,并成功表达了mip/flaA二联优势抗原表位融合蛋白。结论 DNA Star软件和Expasy在线蛋白分析系统能够成功预测嗜肺军团菌Mip和FlaA抗原的表位;选取其优势抗原表位成功构建了pET-mip/flaA二联原核表达载体,并高效表达。