基于miRNA芯片的喉咽鳞状细胞癌对TPF方案诱导化疗敏感性相关miRNA的初步分析

目的运用miRNA芯片筛选与喉咽鳞状细胞癌对TPF方案诱导化疗敏感性相关的差异miRNAs,生物信息学分析确定具有诊疗价值的目标miRNA并进行验证。方法利用Affymetrix GeneChipmiRNAArray4.0芯片对12例TPF方案诱导化疗敏感的原发喉咽鳞状细胞癌患者及9例不敏感的患者的肿瘤组织行差异miRNA的筛选。选择文献中已经报道的和肿瘤发生相关的miRNA作为目标miRNA,并采用RT-PCR在24例原发喉咽鳞癌肿瘤组织(14例敏感,10例不敏感)中验证目标miRNA。结果筛选出24个miRNA在敏感组与不敏感组间表达有显著差异,其中6个miRNA在对TPF方案诱导化疗敏感组中表达上调,18个miRNA表达下调。运用miRNA靶基因预测数据库mirfocus对筛选出的24个差异miRNA进行分析,确定在敏感组中低表达的hsa-miR-211-3p、hsa-miR-4253、hsa-miR-4443、hsa-miR-193b-3p作为目标miRNA。采用RT-PCR对目标miRNA进行验证,hsa-miR-4253、hsamiR-4443、hsa-miR-193b-3p与芯片筛选结果一致。结论hsa-miR-4253、hsa-miR-4443、hsa-miR-193b-3p在诱导化疗敏感组与不敏感组间有显著性差异,可作为治疗方案的选择指标,并为进一步研究喉咽鳞状细胞癌对诱导化疗敏感性奠定分子生物学基础。

miRNA芯片研究大鼠脑创伤后3天皮层miRNA的差异表达

目的筛选大鼠脑创伤3 d后皮层差异表达的miRNA,为颅脑创伤治疗中的miRNA干预策略提供可供选择的目标miRNA。方法将6例创伤后3 d的大鼠大脑皮层组织混匀代表该组样本,将6例正常对照的大鼠大脑皮层组织混匀代表该组样本。利用miRNA芯片检测伤后3 d的创伤大脑皮层组织与正常对照的差异表达基因。并随机挑选差异表达基因作定量聚合酶链反应(PCR)验证。结果与正常对照相比,创伤后3 d组共有251个miRNA表达,其中,2倍以上差异表达上调的20个,2倍以上差异表达下调的5个。定量PCR验证结果提示芯片结果可信。结论创伤大鼠大脑皮层的差异表达miRNA在以前的脑创伤文献中鲜有报道,对其干预有望成为颅脑创伤基因治疗的新方向。

新构建FlaA N/C蛋白辐射防护相关miRNA芯片谱研究

目的通过miRNA芯片谱研究,分析FlaA N/C蛋白辐射防护功能的转录后调控机制。方法FlaA N/C蛋白皮下注射小鼠2h后,取小肠组织进行miRNA芯片谱分析,芯片谱结果用生物信息学方法预测miRNA作用靶点及可能相关的信号通路。结果 FlaA N/C皮下注射后2h有108个miRNA上调,59个miRNA下调,差异miRNA预测靶点主要集中在NF-κB、PI3K-Akt、p53和Caspase等信号通路。结论凋亡相关信号通路在FlaA N/C介导辐射防护机制中具有重要作用,有必要针对凋亡相关miRNAs网络开展辐射防护机制研究。

鹿茸顶端组织miRNA芯片制备及差异表达miRNA的筛选

为制备梅花鹿鹿茸顶端间充质组织及软骨组织miRNA芯片,分离鹿茸间充质和软骨组织细胞,利用TRIzol试剂法分别提取细胞的总RNA,并进行miRNA生物素标记,将标记的小RNA在miRNA芯片上进行杂交反应,再进行芯片扫描及数据处理,应用相对荧光定量Real-time PCR法验证部分miRNA芯片结果的可靠性。研究结果显示:筛选得到鹿茸间充质和软骨组织miRNA差异表达谱。间充质部位存在的miRNA为289个,软骨部位存在的miRNA条数为304条。其中间充质组织中117个miRNA表达上调,71个miRNA表达下调;软骨组织中97个miRNA表达上调,87个miRNA表达下调;两个组织中共同存在且具有显著差异性表达的miRNA为158个。Real-time PCR法验证结果显示,相对于间充质细胞,miR-1、miR-18a、miR-18b、miR-19a、miR-19b、miR-20b和miR-let-7f的表达均上调;而miR-99b、miR-130b及miR-184的表达均下调,与芯片结果一致。

寻常型银屑病三种中医证型外周血单核细胞基因芯片与miRNA芯片关联分析

目的:分析寻常型银屑病三种不同中医证型患者外周血单核细胞基因和mi RNA的表达,并进行关联分析。方法:收集寻常型银屑病三种中医证型(血瘀证、血燥证、血热证)患者62例和健康对照人群10人的外周血,检测外周血单核细胞的基因表达谱和mi RNA表达谱,利用DIANA在线工具及其数据库对基因芯片和mi RNA芯片结果进行关联分析。结果:与健康对照组比较,三种证型共有的差异mi RNA为hsa-miR-485-3p,三种证型共有的差异基因为RBMS1和FAM98B,血瘀证存在靶标关系的特有差异mi RNA和基因为159对,血燥证存在靶标关系的特有差异mi RNA和基因为15对,血热证不存在证型特有差异mi RNA。结论:差异mi RNA通过调控其靶基因的表达参与银屑病的发生及中医分型。

银屑灵片对寻常型银屑病血瘀证患者外周血单核细胞差异表达基因和miRNA芯片结果关联分析

目的使用基因表达谱芯片和miRNA芯片技术分析银屑灵片对寻常型银屑病血瘀证患者治疗前后外周血单核细胞(PBMC)差异表达基因和miRNA,进行关联分析,探讨银屑灵片治疗寻常型银屑病血瘀证的作用机制。方法选择9例寻常型银屑病血瘀证患者,予银屑灵片治疗,并收集健康者9人外周血,制备PBMC,使用基因表达谱芯片和miRNA芯片检测PBMC基因和miRNA表达谱,对结果进行关联分析。结果与健康组比较,治疗前银屑灵片组PBMC的差异miRNA包括hsa-miR-30c-5p等48个miRNA,差异miRNA的靶基因包括PIK3C2B等27个基因;治疗后银屑灵片组PBMC的差异miRNA包括hsa-miR-23c等47个miRNA,差异miRNA的靶基因包括HIVEP2等33个基因。治疗前后银屑灵片组PBMC差异miRNA包括hsa-miR-146b-5p等7个,差异miRNA的靶基因包括MYADM等14个基因。结论通过对治疗前后银屑灵片组患者PBMC表达谱芯片与miRNA芯片结果进行关联分析,提示hsa-miR-146b-5p等7个miRNA及其靶基因DYNLL2等14个基因有可能是银屑灵片治疗寻常型银屑病血瘀证的重要靶点。

利用miRNA芯片筛选大鼠颅脑创伤后皮层差异表达的miRNA

目的筛选大鼠颅脑创伤后皮层差异表达的miRNA，为颅脑创伤治疗中的miRNA干预策略提供可供选择的目标miRNA。方法利用miRNA芯片检测伤后6h、24h、48h、72h组各2例创伤大脑皮层组织与2例正常对照的差异表达基因。并随机挑选差异表达基因做PCR验证。结果创伤后6h组共有136个miRNA表达，其中2倍以上差异表达上调的13个，2倍以上差异表达下调的14个；24h组共有118个miRNA表达，其中2倍以上差异表达上调的4个，2倍以上差异表达下调的23个；48h组共有149个miRNA表达，其中2倍以上差异表达上调的16个，2倍以上差异表达下调的11个；72h组共有203个miRNA表达，其中2倍以上差异表达上调的19个，2倍以上差异表达下调的5个。其中只有miR-21在4个伤后时间点上均高表达，分别为2．0215、2．0401、2．0702、2．7910。定量PCR验证结果提示芯片结果可信。结论创伤大脑皮层的差异表达miRNA在以往文献中鲜见报道，对其干预有望成为颅脑创伤基因治疗的新靶向。

应用微孔板芯片分析机采血小板常温保存过程中凋亡相关miRNA的表达改变

目的分析机采血小板在常温保存过程中凋亡相关miRNA的表达改变。方法应用miRNA微孔板芯片技术研究常温保存机采血小板在不同保存时间凋亡相关miRNA的差异表达谱,采用生物信息学软件预测发生差异表达的miRNA可能的靶基因及相关生物学功能。结果与新鲜血小板相比,常温保存7 d的血小板,有7种miRNA发生了显著变化。其中miR-16、Let-7b、miR-26和Let-7c的表达上调,miR-7、miR-145和miR-197的表达下调。结论筛选出的差异表达miRNA可能参与了血小板的保存损伤过程。

青年羊驼耳部和背部皮肤组织中miRNA差异表达研究

羊驼是毛用型经济动物,其耳部和背部的毛发品质和生长速度存在差异.MicroRNA(miRNA)是新发现的一类在转录后水平调控基因表达的非编码RNA分子,为比较miRNA在羊驼耳部和背部皮肤的表达差异,从而探讨miRNA在羊驼皮肤和毛囊发育过程中的调控作用,本实验提取羊驼皮肤总RNA,制备了羊驼皮肤miRNA芯片,通过与Affymetrix多物种miRNA芯片跨物种杂交对耳部和背部皮肤的miRNA进行筛选,并通过实时荧光定量PCR进行了验证,同时利用在线生物信息软件预测miRNA靶基因.结果显示,羊驼耳部和背部皮肤中高表达差异2倍以上的miRNA有39个,实时荧光定量PCR检测let-7b和miR-24在2个部位皮肤中的差异表达量与miRNA基因芯片结果一致;预测到let-7b和miR-24的靶基因中包含有与毛囊生长发育和毛发品质相关的基因,提示这些miRNA可能参与羊驼皮肤和毛囊的生长发育、更新以及毛发品质的调控.

肺炎支原体肺炎外周血miRNAs差异表达谱的筛选与验证

目的筛选肺炎支原体肺炎(MPP)患儿差异表达的血浆miRNAs,并予以验证。方法入选36例MPP患儿,27例健康对照儿童;对3例MPP患儿及3例对照儿童的血浆样本进行miRNA芯片筛选,获得miRNA表达谱;RT-qPCR法检测全体研究对象外周血白细胞中miR-222-3p及miR-492的表达量并进行比较。结果 MPP患儿血浆中筛选出26条与对照组有显著差异的miRNAs,其中19条mi RNAs表达上调,7条miRNAs表达下调;与对照组比较,MPP组miR-222-3p及miR-492的表达上调,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 MPP患儿部分mi RNAs表达有变化,可能参与MPP的免疫发病机制。

利用芯片技术筛选肝癌早期复发密切相关的microRNA

目的:应用miRNA芯片技术筛选肝癌早期复发密切相关的miRNA,为进一步深入探讨miRNA在介导肝癌高侵袭性及术后早期复发中的作用打下基础。方法:从本院肝癌标本库中选取10例肝癌患者进入本研究,其中早期复发组(术后第1年出现肝内复发病灶)和非早期复发组(术后2年以上未出现肝癌复发或转移)各5例,抽提总RNA并分离出小分子RNA进行Cy3荧光标记,将标记的小分子RNA与miRNA芯片进行杂交反应,分析差异表达的miRNA。结果:相对于非早期复发组,早期复发组肿瘤标本中有miR-602、miR-451、miR-144和miR-486-5p等4个miRNAs表达显著上调(上调倍数>2.0);有miR-551b、miR-96和miR-502-3p等3个miRNAs表达显著下调(下调倍数<0.5)。结论:筛选得到肝癌早期复发的miRNA差异表达谱,其可能与肝癌的早期复发发生发展有关。

子宫内膜癌Ⅰ型和Ⅱ型miRNA表达谱差异的分析

目的:分析Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌及良性子宫内膜组织间MiRNA表达谱差异。方法:收集Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌患者内膜及良性患者内膜组织,采用mirVana RNA isolation kit提取总RNA,利用芯片检测miRNA表达谱差异。结果:Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌及良性内膜组织间均有差异表达的miRNA,其中Ⅰ型内膜癌与良性内膜组织间存在59个表达差异miRNAs,Ⅱ型内膜癌与良性内膜组织间存在13个差异表达miRNAs,Ⅰ型与Ⅱ型子宫内膜癌间存在30个差异表达miRNAs。结论:Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌间miRNA的表达差异可能与不同类型子宫内膜癌的发生发展相关,可为进一步研究子宫内膜癌发生的分子机制提供依据。

胚胎期及哺乳期全氟辛烷磺酸盐(PFOS)暴露对大鼠长时程突触可塑性影响的miRNA组学研究

为探讨PFOS胚胎期及哺乳期暴露对动物子代学习记忆能力影响的分子机理,采用微小RNA(miRNA)芯片技术检测PFOS胚胎期及哺乳期暴露对出生第1和7天大鼠脑组织miRNA表达的影响,分析突触可塑性相关miRNA表达的差异变化。结果显示,经PFOS暴露后出生第1和7天的大鼠脑组织中分别有24和17个miRNA发生显著性差异表达(p<0.05),其中与突触传递和神经递质转运等相关的miRNA的差异表达最为显著,主要包括miR-466b、miR-672、miR-297、miR-674-3p和miR-207。差异表达miRNA的路径分析显示出生后1和7d的大鼠的长时程增强效应(LTP)均受PFOS显著影响(p<0.05),这说明PFOS胚胎期及哺乳期暴露可能通过影响LTP的形成、发展和维持过程对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁,并且miR-466b、miR-672、miR-297、miR-674-3p和miR-207可能参与了其中的调控过程。

小鼠间充质干细胞脂向分化过程中miRNA-143的表达

目的探讨小鼠间充质干细胞(MSCs)脂向分化过程中miRNA-143(miR-143)的表达,为阐明MSCs脂向分化的调控机制提供新线索。方法采用全骨髓体外分离结合差速贴壁法纯化扩增C57BL/6小鼠MSCs,将第5代MSCs采用脂肪细胞分化诱导剂进行成脂诱导。运用miRNA芯片技术比较MSCs组和脂肪细胞组中miR-143的表达,并通过实时定量PCR技术验证。结果成功分离、纯化和培养MSCs;MSCs经脂肪诱导剂诱导后,胞内大量脂滴形成,油红O染色阳性。MiRNA芯片及实时定量PCR结果均表明miR-143在MSCs脂向分化过程中显著上调(3.73±0.42 vs 1.00±0.14,P<0.01)。结论 miR-143可能参与调控MSCs的脂向分化。

索拉非尼对肝癌患者血清中肿瘤相关miRNAs的影响

目的 探讨索拉非尼治疗前后对肝癌患者血清中肿瘤相关miRNA表达谱改变情况.方法 收集2011年10月～2012年9月在绍兴第二医院及浙江大学医学院附属第一医院接受治疗的6例肝癌患者的血清样本,采用miRNA表达谱芯片检测HCC患者经索拉非尼治疗前后血清中差异表达的miRNAs,并应用实时荧光定量PCR（RT-PCR）对筛选出的miRNAs进行验证.结果 索拉非尼治疗前后肝癌患者血清miRNA表达谱出现明显改变,16个miRNAs在索拉非尼治疗后肝癌患者血清中表达明显升高,10个miRNAs在索拉非尼治疗后肝癌患者血清中表达明显降低.治疗前肝癌患者血清miR-122相对表达值为（1.07±0.32）,治疗1个月后的miR-122相对表达值为（9.10±1.89）,差异有统计学意义（P＜0.05）,较治疗前表达水平显著上调.结论 索拉非尼治疗前后肝癌患者血清中表达谱发生明显变化,索拉非尼对肝癌相关miRNAs的调控可能是其治疗肿瘤的重要机制之一.

补肾方含药血清干预大鼠椎间盘软骨细胞miRNA的差异表达

目的筛选补肾方含药血清干预大鼠椎间盘软骨细胞后差异表达的miRNA,为补肾方治疗颈椎病提供可供选择的目标miRNA,以探讨其通过调控靶基因表达发挥治疗效应的机制。方法原代培养的大鼠椎间盘软骨细胞经Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色鉴定后,分别用补肾方含药血清、空白血清干预椎间盘软骨细胞,在给定时间点收获细胞,抽提纯化总RNA,行miRNA芯片检测,通过芯片差异性分析,挑选差异表达4倍以上的miRNA行定量聚合酶链式反应(PCR)验证。结果二次酶消化法可简便高效培养大量原代椎间盘软骨细胞,所培养细胞具有典型的椎间盘软骨细胞形态和功能,Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色均为阳性。补肾方含药血清干预组芯片数据分别与相应时间点的空白血清组芯片数据行组间比较后再行组内比较,与含药血清干预椎间盘软骨细胞1 d相比,干预3 d的共有121个2倍以上表达差异的miRNA,其中上调的53个,下调的68个。差异表达4倍以上的miRNA定量PCR结果与芯片数据一致。结论补肾方含药血清干预椎间盘软骨细胞获得了一套较为特异的miRNA,初步预测上调的miRNA可能通过靶向Opn、Col、Bcl212、Vdr、IGF-I、Mmp-13等基因在椎间盘营养代谢相关信号通路中发挥作用。

miRNA-497与miRNA-195基因簇在宫颈癌组织中的表达及预测靶基因的生物信息学分析

目的探讨miRNA-497-195基因簇在宫颈癌组织中的表达,并对其预测的靶基因进行生物信息学分析,为miRNA-497-195基因簇在宫颈癌发生中的作用机制研究提供理论基础。方法收集2010年3月～2012年3月在广西壮族自治区人民医院就诊患者的宫颈标本,利用miRNA芯片技术检测宫颈病变组织中miRNA表达谱,用real-time RT-PCR进行验证;采用real-time RT-PCR检测miRNA-497和miRNA-195在宫颈病变组织中的表达情况,并用Spearman法进行miRNA-497与miRNA-195相关性分析。通过生物信息学预测miRNA-497和miRNA-195的靶基因,并对其靶基因进行GO（gene ontology）功能富集分析及信号转导通路富集分析。结果芯片结果显示,宫颈癌及高度鳞状上皮内瘤变中miRNA-195和miRNA-497表现为下调（均P〈0.05）。real-time RT-PCR结果显示,miRNA-497和miRNA-195在宫颈癌组织中表现为下调,且表达存在显著性相关（r=0.983,P〈0.05）。miRNA-497和miRNA-195预测靶基因大量重合,且集合功能也大量重合,并富集于细胞周期调控、生物学过程调控、转录调控、基因表达及核苷酸代谢过程等生物学过程,以及蛋白结合、核酸结合、蛋白激酶活性、连接酶活性等分子功能（P〈0.01）;KEGG通路分析涉及癌症通路、p53信号通路、GnRH信号通路、细胞外因子信号通路等信号传导通路及直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、慢性粒细胞性白血病、非小细胞肺癌等疾病通路（P〈0.05）。结论 miRNA-195和miRNA-497在宫颈癌组织中呈现低表达,二者表达呈显著正相关,miRNA-497-195基因簇可能是宫颈癌的抑制因子。miRNA-497和miRNA-195预测靶基因功能大量重合,并显著富集在与肿瘤发生相关的信号通路中。

三阴性乳腺癌差异表达miRNA的筛选

目的应用miRNA芯片技术筛选三阴性乳腺癌及癌旁组织差异表达的miRNAs,为进一步阐明其在三阴性乳腺癌发病机制中的作用奠定基础。方法收集8例新鲜的三阴性乳腺癌及其癌旁组织,抽提总RNA进行Hy3荧光标记,miRCURYTMLNA Array(v.16.0)(Exiqon)芯片上进行杂交反应,实时定量PCR验证miRNAs芯片结果的可靠性。结果对芯片进行图像扫描和数据分析,筛选获得17个三阴性乳腺癌相关miRNAs,其中7个miRNAs表达上调,10个miRNAs表达下调;显著上调的有miR-93、miR-328,显著下调的有miR-145、miR-205。结论筛选得到三阴性乳腺癌miRNA差异表达谱,其可能与三阴性乳腺癌的发生发展有关。

大鼠腹部手术应激后血清miRNA表达谱的差异分析

目的:应用miRNA芯片技术建立大鼠腹部手术应激后血清miRNA差异表达谱,从中发现与早期手术创伤后应激相关的miRNAs。方法:建立大鼠部分肝切除手术模型。检测手术前后大鼠血清中ALT、AST和CRP浓度水平及肝脏病理改变,评估腹部创伤后大鼠应激情况。采用miRNA表达谱芯片筛选手术前后大鼠血清中差异表达的miRNAs,并采用实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)进行验证。采用生物信息学软件(MiRand和Target Scan)预测候选miRNA的靶基因。结果:血清miRNA表达谱出现明显改变,24个miRNAs在2/3部分肝切除术(PH)后24h大鼠血清中表达明显升高,特别是miR-9,其在2/3PH术后24h大鼠血清中的表达水平为术前的50多倍,real-time RT-PCR检测miR-9的结果与芯片结果相符。通过生物信息学预测,CDH1、E-cadherin、MTHFD2、PDYN、MCPIP1、BCL2L11、CMA1、Map3k1等可能是miR-9的靶基因。结论:腹部手术创伤后,大鼠血清表达谱发生明显变化,提示miRNA可能参与调控创伤后应激反应。

宣威地区肺腺癌病人肺组织特异miRNAs表达谱和靶基因及其信号通路预测

目的筛选出宣威地区肺腺癌病人肺组织miRNAs差异表达谱,预测其相关靶基因和信号通路。方法选取来自宣威地区肺腺癌24例和非宣威地区肺腺癌10例患者手术切除的肺癌组织和正常肺组织标本,miRNAs芯片检测34对肺癌切除标本,筛选宣威肺腺癌miRNAs差异表达谱,AGO分析和KEGG Pathway分析预测其miRNAs的生物与肺癌相关的靶基因和信号通路。结果 miRNAs芯片检测:与非宣威肺腺癌比较,宣威肺腺癌差异表达显著的特异miRNAs 34个:表达上调的miRNAs有23个,表达下调的miRNAs有11个。AGO富集分析及KEGG数据库映射分析发现:预测主要集中在PI3K/Alt信号通路附近,其预测靶基因有:GF、RTK、SOS、IRS1、BCAP、CYTOKINSR、ECM、ITGB、FAK和GβY,可能对肺癌生物学功能产生影响的靶基因主要集中在PI3K/Alt,WNT和MAPK通路。结论筛选出这些特异性miRNAs可能在宣威肺腺癌癌变和进展中起重要作用,预测的靶基因可能与调节PI3K/Alt,WNT和MAPK信号通路的作用有关。