落叶松-杨栅锈菌MKK基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆技术,从落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb.)菌株Wh03中克隆得到酿酒酵母MKK1和MKK2的同源基因,命名为Mlp MKK1/2-WH。测序结果显示,Mlp MKK1/2-WH基因的开放阅读框长度为1 218 bp,编码405个氨基酸。Mlp MKK1/2-WH蛋白具有保守的PKc_Pek1_like和Pkinase结构域。系统进化树分析表明,Mlp MKK1/2-WH与柄锈菌属3种锈菌中的同源蛋白亲缘关系最近。

油菜MKK2基因原核表达及特性分析

MAP激酶级联途径在信号传导过程中发挥着重要作用.以白菜型冬油菜"陇油6号"为材料,利用RT-PCR法克隆到全长MKK2基因cDNA,生物信息学分析表明油菜MKK2蛋白为亲水蛋白,包含有MAPKK蛋白所特有的磷酸化基序S/T-X_(3-5)-S/T.将其与大肠杆菌表达载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-MKK2,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blotting检测结果表明该基因表达了1个约43 kD的蛋白.实时荧光定量PCR结果显示该基因表达没有组织特异性,其转录受UV-B胁迫的诱导.

MKK4基因在喉鳞癌中的表达及其临床意义

目的:研究丝裂原活化蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义。方法:应用RT-PCR和免疫组织化学方法检测42例喉鳞癌、20例喉乳头状瘤及20例声带息肉组织中MKK4 mRNA和蛋白的表达,分析其与喉鳞癌临床病理参数之间的关系。结果:MKK4 mRNA和蛋白表达的阳性率在喉鳞癌、喉乳头状瘤及声带息肉组织中逐渐降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。MKK4 mRNA和蛋白的表达随喉鳞癌的浸润深度增加而上升(P<0.05),在有淋巴结转移组中的表达高于无淋巴结转移组(P<0.05),在临床Ⅲ～Ⅳ期患者中的表达高于临床Ⅰ～Ⅱ期的患者(P<0.05)。MKK4的表达与患者的年龄、性别、肿瘤发生部位及组织学分级无相关性(P>0.05)。结论:MKK4 mRNA和蛋白在喉鳞癌组织中的表达上调可能与喉鳞癌的发生及浸润转移有关,MKK4可能成为一个潜在的判断喉鳞癌发生与转移的观测指标。

mkk4基因启动子区多态性对结肠癌易感性的影响

目的通过检测结肠癌患者mkk4启动子区单核苷酸多态性位点及其与蛋白表达的关系,探讨mkk4基因多态性与结肠癌易感性的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态技术(PCR-rflp)分别检测120例结肠癌患者与120例健康对照组的mkk4基因这两处位点多态性,并用免疫组化的方法观察结肠癌组织的mkk4表达量。结果发现在rs3826392(T/G)位点结肠癌组携带G变异基因型(T/G+G/G)频率显著低于健康对照组(P=0.043,OR=0.576,95%CI=0.337～0.985);肿瘤组织中mkk4蛋白表达在G变异基因型中明显增高(P<0.001);rs3809728(A/T)则无统计学意义。结论 mkk4基因rs3826392(T/G)位点G变异与mkk4的表达增加和结肠癌的发病风险降低相关,是结肠癌发病的一个保护因素。而rs3809728(A/T)多态性则与散发性结直肠癌无明显相关。

木薯MKK家族基因的鉴定及表达分析

MAPK级联传导通路是广泛存在于真核生物体内的信号传导途径。根据木薯全基因组数据,借鉴拟南芥中MAPKK(MKK)家族的基因序列,通过生物信息学方法对木薯中MKK家族成员进行全面的鉴定以及系统进化树分析。通过激素处理及病原菌接种来分析MKK家族各基因的表达模式。结果表明,木薯总共编码11个MKK基因,这些基因集中分布于木薯第3,4,6,10,12,16,17条染色体上。MKK家族各基因在木薯受到激素处理及病原菌处理后的表达分析结果表明,MKKs能够响应ABA,JA及病原菌信号,对ACC信号则不敏感。MKK4,MKK5,MKK8,MKK9,MKK11可能参与木薯相关防御病原菌及激素信号传导通路。

中国明对虾MKK4基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达分析

为初步研究中国明对虾MKK4的生物学功能,采用RACE技术克隆获得中国明对虾MKK4基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾MKK4基因全长为2 064 bp,开放阅读框长1 221 bp,5'非编码区长214 bp,3'非翻译区长629 bp。将该基因命名为Fc MKK4。推测该基因编码406个氨基酸,预测分子量为45.94 ku,理论等电点为8.50。同源性和系统进化分析发现Fc MKK4与肩突硬蜱和印度跳蚁的同源性分别为80%和78%,与其他节肢动物MKK4聚为一支。荧光定量RT-PCR结果表明,Fc MKK4基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为肝胰腺。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达谱式,表明Fc MKK4可能参与中国明对虾非生物胁迫的应答反应。

中国明对虾MKK3基因cDNA克隆及其在氨氮胁迫下的表达

采用RACE技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)丝裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3)基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果表明,该基因全长为1434 bp,开放阅读框长1011 bp,5′非编码区长33 bp,3′非编码区长390 bp,将该基因命名为Fc MKK3。推测该基因编码336个氨基酸,分子量为37.89 k D,理论等电点为6.08。同源性和系统进化分析表明,Fc MKK3基因与丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)和地中海实蝇(Ceratitis capitata)的相似性分别为69%和68%,与其他节肢动物MKK3聚为一类。荧光定量RT-PCR结果表明,Fc MKK3基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为鳃。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肠、鳃、胃、心脏、肝胰腺、肌肉和血细胞中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达趋势,表明Fc MKK3基因可能在中国明对虾应对非生物胁迫反应的过程中起着重要的作用。

斑节对虾MKK4基因的表达分析

从斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组织cDNA文库中筛选并获得了斑节对虾MKK4基因的cDNA片段,然后采用荧光定量的方法研究了MKK4基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明,MKK4的mRNA在各组织中都有表达,其中在未成熟精巢中表达量最高,其次分别为雌、雄个体的肠。在精巢不同发育阶段,其在未成熟精巢的表达量极显著高于成熟精巢。对卵巢不同发育期的研究表明,从Ⅱ期开始,随着卵巢的发育,MKK4mRNA的表达量逐渐增加,到第Ⅵ期时表达量达到最高。而在Ⅰ期的表达量虽高于Ⅱ期和Ⅲ期、低于Ⅳ期,但其与其他3期均无显著差异。

MKK4基因的抑癌及致癌作用

丝裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)基因为新近发现的肿瘤转移抑制基因。其编码蛋白可激活c-Jun氨基端激酶和p38这两条丝裂原活化蛋白激酶通路,将细胞外刺激信号转导至细胞核内,引起细胞的增殖、分化、转化及凋亡。MKK4基因具有抑癌作用,随着MKK4基因启动子区Rs3826392(T/G)位点G变异个数增加,结肠癌、肺癌及鼻咽癌的患病率会随之降低。与之相反,MKK4基因同时具有致癌作用,其表达上调可能与胰腺癌、前列腺癌的发生及浸润转移有关。

增生性瘢痕内应激活化蛋白激酶及其上游信号分子基因表达的变化

目的 探讨增生性瘢痕和自身对照正常处皮肤中应激活化蛋白激酶 (SAPK)及其上游信号分子MAPKs(MKK4和 MKK7)基因表达的变化。 方法 提取 8例增生性瘢痕和自身对照正常处皮肤组织的总 RNA后 ,分离纯化 m RNA,用 RT- PCR方法检测 SAPK,MKK4和 MKK7基因在不同组织中的表达变化规律。 结果 增生性瘢痕中 ,MKK7和 SAPK基因表达较弱 ,自身对照皮肤组织中 ,这两种基因 PCR结果的灰度比分别为增生性瘢痕的 1.5倍和 2 .6倍 ,基因表达量明显升高 (P<0 .0 1) ,而 MKK4在这两种不同类型组织中的表达量无统计学意义 (P>0 .0 5 )。 结论 增生性瘢痕中 MKK7和 SAPK基因表达降低引起细胞凋亡减少 ,可能是瘢痕内成纤维细胞大量增殖 ,增生性瘢痕形成的机制之一。

增生性瘢痕内p38丝裂素活化蛋白激酶及其MAPKKs基因的表达

为探讨增生性瘢痕和正常皮肤中p3 8丝裂素活化蛋白激酶 ( p3 8MAPK)及其上游信号分子mkk3和mkk6基因表达的变化 ,提取 8例增生性瘢痕和 8例正常皮肤组织的总RNA后 ,分离纯化mRNA ,用RT PCR方法检测这 3种基因在不同组织中的表达变化规律。结果显示 ,在正常皮肤组织中 ,mkk6和p3 8MAPK基因表达较弱 ,而在增生性瘢痕内 ,这 2种基因PCR产物的灰度比分别为正常皮肤的 1 2倍和 1 9倍 ,基因表达量明显升高 (P <0 0 5和P <0 0 1) ,而mkk3在这两种不同类型组织中的表达量没有显著性差异 (P >0 0 5 )。提示增生性瘢痕的发生可能与mkk6和 p3 8MAPK基因表达升高有关 。

MKK4在肿瘤发生发展中的作用

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,在调控细胞凋亡、生长以及一些重要基因的表达中发挥重要作用[1]。现已经确认在哺乳动物中存在4条不同的MAPK通路：

胎儿和出生后机体皮肤内p38MAPK及MAPKKs基因表达变化的比较性研究

目的 探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(p38mitogen- activated protein kinase,p38MAPK)及其上游信号分子MAPKKs(mkk3和mkk6 )基因,在不同胎龄胎儿皮肤和出生后机体皮肤组织中表达的变化,及其可能的生物学意义。 方法 用病理学技术检测不同发育时期皮肤的结构特征后,提取18例不同胎龄(13～32周)的胎儿皮肤和6例出生后机体皮肤组织(作为对照)的总RNA,分离m RNA,用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription- polymerasechain reaction,RT- PCR)方法检测3种基因在不同组织中的表达规律。 结果 p38MAPK,m kk3和mkk6基因在不同发育阶段的皮肤组织中都有表达。在早期妊娠胎儿的皮肤组织中,这三种基因表达较强,随着胎儿的生长发育,皮肤组织内这三种基因表达逐渐减弱。在出生后机体的皮肤细胞中,p38MAPK、mkk3和mkk6基因的表达量分别为妊娠早期皮肤的39.6 %、6 3.5 %和5 4 .5 % ,明显减弱(P<0 .0 1)。 结论 p38MAPK、mkk3和mkk6基因在不同发育阶段人皮肤组织内都有表达,显示细胞外信号引起的p38MAPK信号通路可能对皮肤的发生、结构功能的维持以及伤后修复十分重要。在早期妊娠胎儿皮肤中p38MAPK及其上游信号分子MAPKKs基因的高表达可能是胎儿皮肤组织细胞快速增殖、皮肤创面无瘢痕愈合的机制之一。

胎儿和出生后机体皮肤内p38MAPK及其MAPKKs基因表达变化的比较性研究

目的:探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)及其上游信号分子MAPKKs(mkk3和mkk6)基因在不同胎龄的胎儿皮肤和出生后机体皮肤组织中表达的变化及其可能的生物学意义。方法:用病理学技术检测不同发育时期皮肤的结构特征后,提取18例不同胎龄(13～32周)的胎儿皮肤和6例出生后机体皮肤组织的总RNA,分离mRNA,用RT-PCR方法检测这3种基因在不同组织中的表达变化规律。结果:p38MAPK,mkk3和mkk6基因在不同发育阶段的皮肤组织中都有表达。在早期妊娠胎儿的皮肤组织中,这3种基因表达较强,随着胎儿的生长和发育,皮肤组织内这3种基因表达逐渐减弱。在出生后机体的皮肤细胞中,p38MAPK,mkk3和mkk6基因的表达量分别为妊娠早期皮肤的39.6%,63.5%和54.5%,基因表达明显减弱(P<0.01)。结论:p38MAPK,mkk3和mkk6基因在不同发育阶段人皮肤组织内都有表达,显示细胞外信号引起的p38MAPK信号通路可能对皮肤的发生、结构功能的维持以及伤后修复十分重要。在早期妊娠胎儿皮肤中p38MAPK及其上游信号分子MAPKKs基因的高表达可能是胎儿皮肤组织细胞快速增殖,皮肤创面无瘢痕愈合的机制之一,但深层次机制还需进一步研究。

siRNA介导的MKK4表达抑制研究

采用脂质体转染方法,将3对(siRNA ID#64447、siRNA ID#64539和siRNA ID#186583)人工合成的MKK4基因特异的小分子干扰RNA(siRNA)分别导入小鼠成肌细胞C2C12中。实时荧光定量PCR结果表明,转染了siRNA ID#64447的细胞,其MKK4 mRNA的表达水平下调得最多,约为85%。试验获得了能够高效下调MKK4基因表达的siRNA。

油菜BnMKK4全长基因的克隆及表达分析

从‘陇油6号’油菜中克隆得到了一个新的BnMKK4基因的cDNA,全长1317bp,其中包括993bp的开放阅读框,159bp的5'非翻译区(5'UTR),165bp的3'非翻译区(3'UTR)。与拟南芥AtMKK4有很高的同源性,因此命名为BnMKK4(GenBank登录号为JF268686)。该基因编码330个氨基酸的蛋白质,分子量36.5kDa,等电点为9.01。实时荧光定量PCR结果显示该基因表达受低温胁迫和盐胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫和盐胁迫的过程中发挥作用。

MKK4基因启动子区-1304T/G多态性与散发性鼻咽癌易感性的关系

目的：探讨丝裂原活化蛋白激酶的激酶MKK4基因启动子区-1304T/G多态性与散发性鼻咽癌遗传易感性的关系。方法：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测30例健康人和90例鼻咽癌患者的MKK4基因-1304T/G位点单核苷酸多态性。结果：鼻咽癌患者TG＋GG基因型的频率明显高于对照人群（82.2%vs 66.7%,χ~2=10.076,P〈0.05）,与-1304TT基因型相比,-1304TG杂合子患鼻咽癌的风险降低了0.56倍（95%CI=0.164-1.178,P〈0.01）,-1304GG型降低了0.58倍（95%CI=0.126-1.381,P〈0.01）,变异基因型TG＋GG患鼻咽癌的风险降低了0.72倍（95%CI=0.105-0.753,P〈0.01）。结论：MKK4基因-1304T/G基因多态性与鼻咽癌发病风险有关,-1304G变异能降低鼻咽癌患病风险,是散发性鼻咽癌的独立保护因素。

细粒棘球蚴MKK1和MKK2基因原核表达载体的构建及其诱导表达

目的分别构建细粒棘球蚴(Eg)丝裂原活化蛋白激酶激酶MKK1和MKK2基因原核表达载体,诱导表达并纯化EgMKK1和EgMKK2蛋白。方法采集绵羊肝脏感染的Eg原头蚴,Trizol法提取原头蚴总RNA,反转录PCR分别扩增EgMKK1和EgMKK2基因片段,克隆至原核表达载体pET28a(+),经限制性内切酶双酶切和测序鉴定正确后转化大肠埃希菌感受态细胞BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化蛋白,并进行SDS-PAGE分析。结果测序证明pET28a-EgMKK1和pET28a-EgMKK2原核表达载体构建正确,在37℃经IPTG(终浓度1mmol/L)诱导可表达EgMKK1和EgMKK2蛋白,分子质量单位分别为44.96ku和64.01ku,与理论值相符,且以包涵体形式存在。表达产物纯化后的可溶性蛋白EgMKK1和EgMKK2含量分别为0.64mg/ml和1.2mg/ml。结论成功构建了MKK1和MKK2基因原核表达载体,表达蛋白可用于动物免疫,为研究EgMKK1和EgMKK2在Eg体内的生物学作用奠定了基础。

MKK4基因-1304T>G单核苷酸多态性与结直肠癌的关联研究

目的评价MKK4基因-1304T>G(rs3826392)单核苷酸多态性与结直肠癌发病风险的相关性。方法收集结直肠癌患者218例(试验组)和健康人群206例(对照组)的资料。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RLFP)检测患者-1304T>G位点的等位基因及基因型。结果与T等位基因相比,携带G等位基因的患者结直肠癌发病率显著降低(P<0.05);与TT基因型相比,携带TG、GG、TG+GG基因型的患者结直肠癌发病率更低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 MKK4基因-1304T>G单核苷酸多态性与结直肠癌的发病风险存在相关性。

一例Bardet-Biedl综合征患者MKKS基因新变异的遗传学分析

目的对一例Bardet-Biedl综合征(Bardet-Biedl syndrome,BBS)患者进行遗传学分析。方法收集患者的临床资料,对患者进行纤毛病相关基因的高通量测序,并对候选变异进行生物信息学分析。结果在先证者中检出MKKS基因c.635C>T(p.Ser212Phe)和c.1664C>G(p.Thr555Arg)杂合变异及TMEM67基因c.2498T>C(p.Ile833Thr)杂合变异。其母亲携带MKKS基因c.635C>T(p.Ser212Phe)杂合变异,而未携带MKKS基因c.1664C>G(p.Thr555Arg)及TMEM67基因c.2498T>C(p.Ile833Thr)变异。上述3个变异位点所对应的氨基酸序列在不同物种中高度保守。结论MKKS基因c.635C>T(p.Ser212Phe)和c.1664C>G(p.Thr555Arg)复合杂合变异可能为患者的遗传学病因。TMEM67基因c.2498T>C(p.Ile833Thr)杂合变异对其疾病表型是否具有修饰作用还有待进一步的研究。