CircASH2L调节miR-128-3p/MKNK2轴对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的影响

目的:研究环状RNA缺失-小同源异形-2样蛋白(CircASH2L)调节miR-128-3p/MAP激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶2(MKNK2)轴对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的影响。方法:实时荧光定量PCR检测人卵巢癌细胞株SKOV3和人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3-TR30中miR-128-3p与CircASH2L、MKNK2表达。体外培养SKOV3-TR30细胞,随机分为对照组、紫杉醇组、紫杉醇+阴性对照组、紫杉醇+CircASH2L敲低组、紫杉醇+CircASH2L敲低+miR-128-3p inhibitor组,分组处理后,检测各组细胞增殖率、凋亡率,miR-128-3p及CircASH2L、MKNK2、多重耐药1(MDR1)、多药耐药相关蛋白5(MRP5)mRNA表达,MKNK2及P-gp、MRP5蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验检测SKOV3-TR30中CircASH2L对miR-128-3p的靶向调节及miR-128-3p对MKNK2的靶向调节。结果:与SKOV3细胞相比,SKOV3-TR30细胞中CircASH2L与MKNK2 mRNA表达升高,miR-128-3p表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组、紫杉醇组分别相比,紫杉醇+CircASH2L敲低组的细胞增殖率降低,CircASH2L及MKNK2、MDR1、MRP5 mRNA表达降低,MKNK2及P-gp、MRP5蛋白表达降低,细胞凋亡率、miR-128-3p表达均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);紫杉醇组、紫杉醇+阴性对照组细胞各指标无明显变化(P>0.05)。下调miR-128-3p可逆转敲低CircASH2L对紫杉醇处理下SKOV3-TR30细胞各指标变化。CircASH2L可靶向下调SKOV3-TR30中miR-128-3p且miR-128-3p可靶向下调MKNK2。结论:敲低CircASH2L可通过促进miR-128-3p表达而下调MKNK2表达,进而抑制卵巢癌细胞的紫杉醇耐药性。

miR-26b-5p通过下调MKNK2/eIF4E信号通路抑制胰腺癌细胞的增殖及侵袭

目的:筛选胰腺癌(PC)侵袭相关微小RNA(miRNA,miR),验证其生物学功能和调控的信号通路,为胰腺癌的诊治提供新的分子标志物和靶点。方法:通过基因表达综合数据库(GEO)的miRNA表达谱数据集GSE71533和GSE85589,分析miR-26b-5p的差异表达;利用癌症基因组图谱数据库(TCGA),分析miR-26b-5p对PC患者总生存率的影响。采用TargetScan数据库识别miR-26b-5p的靶基因集。通过细胞功能实验,验证miR-26b-5p对PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响。利用基因本体(GO)和KEGG通路富集分析,揭示miR-26b-5p靶基因的功能,并通过蛋白印迹(Western blotting)实验验证miR-26b-5p靶向的信号通路。结果:在GSE71533和GSE85589数据集,相对于正常组织和对照组血浆,miR-26b-5p在PC组织和PC患者血浆明显低表达(9.65±0.10 vs 10.18±0.07,P<0.001;0.67±0.18 vs 0.79±0.24,P=0.017)。TCGA-胰腺癌生存分析结果显示,miR-26b-5p高表达组的总体生存率明显优于低表达组(P=0.023)。KEGG分析显示,预测的251个miR-26b-5p的靶基因与MAPK信号通路有关。CCK-8实验、Transwell迁移、侵袭实验和划痕实验结果显示:miR-26b-5p抑制PANC-1细胞的增殖、迁移和侵袭。KEGG通路富集分析结果提示miR-26b-5p的靶基因参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。Western blotting实验证实miR-26b-5p下调MKNK2/eIF4E信号通路。结论:miR-26b-5p下调MKNK2/eIF4E信号通路,抑制PANC-1细胞增殖、侵袭,有可能作为胰腺癌诊断和治疗的新靶点。

大鼠MKNK2过表达载体构建及其在GH3细胞系的表达

为了扩增克隆大鼠MKNK2基因,构建其真核过表达载体并转染GH3细胞系,研究其对生长激素(GH)的影响,为后续研究MKNK2基因的功能及其在大鼠垂体细胞的作用提供试验基础,试验依据NCBI数据库中预测的大鼠MKNK2基因序列,以大鼠垂体c DNA为模板,采用常规克隆技术获得大鼠MKNK2基因CDs区并对其进行分子遗传进化分析,然后将其构建到真核过表达载体并命名为MKNK2-pc DNA3.1,最后将此过表达载体用LipofectamineTM2000转染GH3细胞,应用qRT-PCR检测GH1和PIT1基因表达。结果表明:成功获得了大鼠MKNK2基因,构建了真核表达载体MKNK2-pc DNA3.1,分子遗传进化分析发现MKNK2基因相对保守。说明过表达大鼠MKNK2基因对GH3细胞的生长相关基因GH1和PIT1具有显著促进作用(P<0.05)。