急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34启动子的克隆及其核心区鉴定

目的:克隆急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34上游启动子序列并检测其活性、鉴定核心区域。方法:PCR扩增MLAA-34基因启动子区全长片段,将其连接至p GL3-Basic载体,克隆重组质粒;构建一系列MLAA-34基因启动子5’侧翼区截短质粒;将含MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒转染至U937、HEK293细胞,应用双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,确定启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果:构建了含有MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒;与空载体相比,其启动子活性明显增加(P <0. 001)。MLAA-34最小活性区域位于转录起始位点-402 bp至-200 bp之间,其中包含E2F1,MZF-1,SP1,USF2和STAT3等多个转录因子结合位点。结论:成功构建急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒,鉴定出核心启动子区,其中含有多个潜在的转录因子结合序列。

水稻OsRZFP34基因逆境表达特征及其启动子的克隆与分析

采用qRT–PCR技术分析水稻OsRZFP34在高温(42℃)、低温(4℃)、10%聚乙二醇(PEG)6000模拟干旱、高盐(100 mmol/L NaCl)和脱落酸(ABA)处理(100μmol/L)下的表达模式;克隆OsRZFP34基因启动子,并利用在线软件New PLACE和PlantCARE对其序列进行顺式作用元件分析;构建OsRZFP34pro::GUS表达载体并转化水稻;通过组织化学染色和GUS酶活性检测,分析在不同胁迫处理条件下OsRZFP34启动子驱动GUS基因表达的活性。qRT–PCR分析结果表明,上述5种处理均能不同程度地诱导OsRZFP34的表达,其中高温胁迫对其表达的诱导程度最强,而ABA对其表达只有微弱的诱导。顺式作用元件分析结果表明,该启动子上包含有多个与逆境响应、激素响应以及Ca^2+信号转导相关元件。GUS组织化学染色和荧光分析结果显示,OsRZFP34基因启动子的活性受到高温、低温、PEG、盐和ABA的调控,表明该启动子是受多种逆境诱导的诱导型启动子。

TNF-α基因启动子-308G/A与PPAR-γ2基因-C34G多态性的交互作用与急性胰腺炎及其严重程度的关系

目的探讨TNF-α基因启动子-308G/A与PPAR-γ2基因-C34G多态性的交互作用与急性胰腺炎(AP)及其严重程度的关系。方法选择轻度AP(MAP)、中度AP(MSAP)和重度AP(SAP)患者各150例,以450例健康体检者作为对照组。利用聚合酶链反应(PCR)技术检测外周血白细胞TNF-α基因启动子-308G/A和PPAR-γ2基因-C34G多态性,并用DNA直接测序法验证结果。结果 -308G/A(GA)、-308G/A(AA)、-C34G(CG)和-C34G(GG)基因型频率分布在MAP组分别为24.00%、26.67%、24.00%、26.00%,在MSAP组分别为34.67%、36.67%、34.00%、36.67%,在SAP组分别为42.00%、46.00%、43.33%、46.00%,在对照组分别为14.44%、14.22%、12.89%、14.67%,基因型频率在MAP组、MSAP组、SAP组与对照组之间均有统计学差异(P均<0.01)。-308G/A(GA)和-308G/A(AA)基因型者患AP的风险均显著增加(ORMAP=2.526 5,ORMSAP=6.182 5,ORSAP=17.876 0;ORMAP=2.570 0,ORMSAP=6.401 8,ORSAP=18.903 4),-C34G(CG)和-C34G(GG)基因型者患AP的风险也显著增加(ORMAP=2.668 4,ORMSAP=6.776 9,ORSAP=22.207 2;ORMAP=2.633 8,ORMSAP=6.472 5,ORSAP=21.570 2)。基因突变的协同分析发现,-308G/A(AA)/-C34G(GG)基因型在MAP组、MSAP组、SAP组和对照组的分布频率分别为7.33%、13.33%、20.67%和2.00%,经χ2检验各组之间均有统计学差异(P均<0.01)。-308G/A(AA)/-C34G(GG)基因型者患AP的风险显著增加(ORMAP=7.284 2,ORMSAP=41.296 1,ORSAP=363.973 6),-308G/A(AA)与-C34G(GG)基因型在AP发生、发展中存在正向的交互作用(γ2MAP=2.114 2,γ4MAP=2.080 0,γ2MSAP=2.108 7,γ4MSAP=2.050 6,γ2SAP=2.138 8,γ4SAP=2.000 1),另外在-308G/A(GA)和-C34G(GG)之间、-308G/A(GA)和-C34G(CG)之间及-308G/A(AA)和-C34G(CG)之间均存在正向交互作用(γ均>1)。结论携带-308G/A(GA)、-308G/A(AA)、-C34G(CG)和-C34G(GG)基因型的个体属AP高危险人群,基因型多态性的交互作用促进了AP的发生、发展。

结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化状态的临床意义探讨

目的探讨结直肠癌组织miR34a启动子区甲基化状态的临床意义。方法收集48例行根治性切除术的结直肠癌患者的癌组织及癌旁正常组织,采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测miR-34a启动子区CpG岛甲基化状态,分析其与患者临床特征及预后的关系。结果结直肠癌组织与癌旁正常组织中miR-34a启动子区甲基化率分别为47.9%、43.8%,差异无统计学意义(P>0.05)。结直肠癌组织miR-34a启动子区甲基化状态与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤最大直径、远处转移等均无关(均P>0.05);与淋巴结转移、TNM分期等均有关(均P<0.05)。结直肠癌组织miR-34a启动子区甲基化患者总生存率、无病生存率均低于非甲基化患者(均P<0.05)。远处转移是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05),但miR-34a启动子区甲基化状态不是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素(P>0.05)。结论结直肠癌组织miR-34a启动子区甲基化状态与患者淋巴结转移、TNM分期及预后有关,可能参与肿瘤进展转移过程的调控。

人CYP17基因启动子5'上游-34碱基处T→C突变与复发性流产

目的:探讨人类CYP17基因启动子5'上游-34碱基处T→C突变与复发性流产的关系,以期为预防和治疗该病易感人群提供新思路。方法:采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,针对CYP17基因启动子5'上游-34碱基处的多态性,检测96例患有原因不明复发性流产患者(病例组)和102例有生育史的健康女性(对照组),并用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进一步验证,且采用测序方法证实实验结果。结果:病例组和对照组CYP17基因启动子5'上游-34碱基处T和C的分布差异有统计学意义(χ2=8.188,P<0.05),CYP17基因各基因型分布差异有统计学意义(χ2=10.096,P<0.05)。杂合突变(T/C)基因型和纯合突变(C/C)基因型患复发性流产的危险度较野生(T/T)基因型分别提高了0.424和0.271倍。结论:人CYP17基因启动子5'上游-34碱基处T→C突变与中国东北地区人群复发性流产有关,C等位基因可能是复发性流产的遗传易感因素之一。

MLAA-22基因上游调控区的分离及启动子活性分析

目的:分离MLAA-22基因上游转录调控区序列,进行启动子活性鉴定。方法:人工合成MLAA-22基因上游转录调控区序列MLAA-22(-999^+1)和MLAA-22(-1999^+1)两个区段,将两个区段插入到双荧光素酶报告基因表达载体psi CHECK-2的BglⅡ/Nhe I限制性内切酶位点中,构建双荧光素酶报告基因表达质粒,将重组质粒分别命名为psi CHECK-2-MLAA-22(-999^+1)和psi CHECK-2-MLAA-22(-1999^+1);采用双荧光素酶报告基因系统检测所分离区段的启动子活性。结果 :MLAA-22(-999^+1)和MLAA-22(-1999^+1)两个区段均具有较强的相对荧光素酶活性,并且MLAA-22(-999^+1)区段的相对荧光素酶活性明显高于MLAA-22(-1999^+1)区段。结论:MLAA-22基因上游转录调控区(-999^+1)区段将是今后我们进行MLAA-22基因上游转录调控区启动子活性研究的重点区域。

启动子甲基化下调宫颈鳞癌组织miR-34a表达

目的:探讨宫颈鳞癌组织miR-34a下调的表达机制。方法:应用茎环RT Realtime-PCR方法检测48例宫颈鳞癌和20例正常宫颈组织中miR-34a的表达;通过甲基化特异PCR检测miR-34a启动子甲基化情况,分析5-Aza-dC去甲基化处理的Caski宫颈癌细胞miR-34a表达变化,观察miR-34a启动子甲基化对miR-34a失调表达的影响。结果:miR-34a在宫颈鳞癌组织中的表达明显低于正常宫颈组织,差异有统计学意义(P<0.05)。甲基化特异PCR检测显示,宫颈鳞癌组织miR-34a启动子区甲基化比率明显高于正常宫颈组织(P<0.05)。5-Aza-dC去甲基化处理人类乳头状瘤病毒(HPV)16阳性的Caski细胞后,miR-34a表达明显升高(P<0.05)。结论:除HPV16 E6外,启动子甲基化也是抑癌基因miR-34a在宫颈鳞癌组织中异常表达的原因。

乳腺癌MiR-34a启动子荧光素酶载体构建及活性测定

提取人乳腺癌细胞(MCF7)基因组DNA,应用PCR扩增miR-34a启动子序列,将其克隆连接到荧光素酶报告质粒p GL3-Basic中;瞬时转染人肾上皮细胞(293T),检测荧光素酶活性。成功构建了p GL3-miR34a-promoter报告基因载体并对其测序验证,结果表明启动子序列正确,载体具有较高的启动子活性。

白血病相关抗原MLAA-34 HLA-A2^+限制性CTL表位的预测及鉴定

目的采用生物信息学方法预测和鉴定白血病相关抗原MLAA-34 HLA-A2+限制性CTL表位,探索基于MLAA-34为靶标的白血病免疫治疗的可能性。方法采用超基序法和量化基序法对靶抗原MLAA-34 HLA-A2+限制性CTL表位进行预测;选取评分较高且排位在前10位的抗原表位肽为候选表位肽,并进行人工合成。利用T2细胞,以肽结合试验及流式细胞术检测各候选CTL表位肽的结合亲和力[以荧光指数(fluorescence index,FI)表示];选取亲和力较高的4种多肽进行特异性CTLs的体外扩增,同时用LDH释放法对CTLs的活性进行检测。结果预测的前10位候选MLAA-34 CTL表位肽中,MLAA2(ILLKNQPKL)、MLAA3(LLTRHKVLV)、MLAA5(LLVTLI-ADL)和MLAA9(YLIKQIRDL)具有较高的亲和力,其FI分别为1.65、1.73、1.82、1.02,可作为候选表位肽进一步分析。细胞毒实验分析显示,MLAA5(LLVTLIADL)可在体外有效诱导特异性CTLs的产生,杀伤靶细胞。结论 MLAA5(LLVTLIADL)为白血病相关抗原MLAA-34的HLA-A2+限制性CTL表位,为基于MLAA-34的治疗性多肽疫苗的设计制备奠定了基础。

白血病相关基因MLAA-34在HeLa细胞中的抗凋亡作用

目的:研究白血病相关基因MLAA-34在He La细胞中的抗凋亡作用。方法:以HeLa细胞株为研究对象,构建MLAA-34重组慢病毒表达载体,建立了高表达MLAA-34的稳定转染Hela细胞株;应用As_2O_3诱导其凋亡,采用MTT法、平板克隆形成实验、流式细胞术分别检测细胞增殖能力、集落形成能力、凋亡及细胞周期分布的变化。结果:应用As_2O_3处理后,稳定转染MLAA-34的Hela细胞株的存活率明显高于对照组,其集落形成能力显著增加;MLAA-34基因高表达显著降低了HeLa细胞的凋亡率,同时相应的降低了G_2/M期细胞的比例。结论:白血病相关基因MLAA-34在HeLa细胞中具有抑制As_2O_3诱导的凋亡作用。

新抗原基因MLAA-34在急性单核细胞白血病患者的表达及意义

目的探讨白血病新肿瘤抗原基因MLAA-34在急性单核细胞白血病(AML-M5)初诊患者中的表达水平,分析其与临床特征及预后的关系。方法采用基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR方法检测MLAA-34在35例AML-M5患者、40例非AML-M5急性髓细胞白血病患者、12例非白血病的血液疾病患者骨髓标本以及10例健康志愿者(正常对照)外周血单个核细胞中的表达水平并进行比较。结果初治AML-M5患者MLAA-34 mRNA表达水平较正常对照、非AML-M5白血病及非白血病疾病患者明显增高(P<0.05);完全缓解的M5患者MLAA-34 mRNA表达水平较治疗前明显下降(P<0.05),复发的M5患者MLAA-34 mRNA表达水平再次增高;对8例复发的AML-M5患者进行MLAA-34基因表达水平动态监测,发现复发前MLAA-34基因表达水平有上升趋势。结论 MLAA-34基因的过表达参与了急性单核细胞白血病的发病,在AML-M5中的表达具有较高的特异性,动态监测其表达水平在AML-M5的疗效评估、预后判断及复发预测方面具有一定的临床意义。

急性单核细胞白血病新抗原MLAA-34基因突变的检测及其与疗效相关性的研究

目的:研究MLAA-34全外显子突变与白血病疗效的相关性。方法:对AML-M5组(40例)及健康对照组(5例),应用RT-PCR方法检测MLAA-34基因的表达水平,研究其对化疗疗效的影响。对该基因全部12个外显子进行测序,研究MLAA-34突变对M5患者OS和PFS的影响;分析白血病重要的5个预后基因突变与MLAA-34基因突变的相关性。结果:M5组MLAA-34基因表达显著高于正常对照组,高表达的患者化疗疗效差。E2外显子第59号碱基存在多态性,C59T位点突变的患者具有更高的MLAA-34基因表达。MLAA-34基因C59T位点突变与重要的分子标志基因FLT-3和DNMT3A的突变显著相关。结论:MLAA-34基因C59T位点突变为白血病复发的高危因素,并可成为一个白血病治疗的候选靶点。

转录因子MZF-1对急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34的转录调控研究

目的:探讨转录因子MZF-1对急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34的转录调控作用。方法:利用双萤光素酶报告基因检测系统及定点突变技术分析MZF-1对MLAA-34基因启动子转录活性的影响。通过凝胶电泳迁移率变动检测(electrophoretic mobility slift assay,EMSA)和染色质免疫沉淀检测(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)实验,验证MZF-1是否与MLAA-34启动子核心区直接特异性结合。构建MZF-1真核表达载体和干涉载体,转染U937细胞,应用RT-PCR和Western blot法检测MLAA-34基因的转录和表达变化。结果:转录因子MZF-1对MLAA-34基因表达具有调控作用,MZF-1结合序列点突变后,相对荧光素酶活性降低(P<0.01)。EMSA和Ch IP实验从细胞内、外水平分别证明MZF-1可与MLAA-34启动子直接结合而发挥调控作用。在过表达试验中,MZF-1的增加可上调MLAA-34的表达(P<0.05);在干涉试验中,MZF-1的降低可下调MLAA-34的表达(P<0.05)。结论:转录因子MZF-1可与MLAA-34基因启动子上的转录调控区结合,并促进急性单核细胞白血病细胞中MLAA-34基因的转录。

转录因子E2F1对急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34的转录调控作用

目的:探讨转录因子E2F1对急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34的转录调控作用。方法:利用双荧光素酶报告基因检测系统及定点突变技术分析E2F1对MLAA-34基因启动子转录活性的影响。通过凝胶迁移实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,验证E2F1是否与MLAA-34启动子核心区直接特异性结合。构建E2F1真核表达载体和干涉载体,转染U937细胞,RT-PCR和Western Blot检测MLAA-34基因的转录和表达变化。结果:转录因子E2F1对MLAA-34基因表达具有调控作用,E2F1结合序列点突变后,相对荧光素酶活性升高(P<0.01),绿色荧光蛋白的表达增高。EMSA和ChIP实验,从细胞内、外水平分别证明E2F1可与MLAA-34启动子直接结合而发挥调控作用。在过表达试验中,E2F1的增加可下调MLAA-34的表达(P<0.05);在干涉试验中,E2F1的降低可上调MLAA-34的表达(P<0.05)。结论:转录因子E2F1可与MLAA-34基因启动子上的转录调控区结合,并抑制急性单核细胞白血病细胞中MLAA-34基因的转录。

全人源抗MLAA-34单链抗体的筛选和鉴定

目的:抗体药物治疗是目前癌症治疗中很有前景的一种方法,利用前期实验得到的MLAA-34纯化蛋白作为抗原,在噬菌体抗体库中进行筛选得到抗MLAA-34的单链抗体,进行测序并鉴定其亲和力。方法:包被纯化的MLAA-34抗原蛋白于96孔板上,封闭过夜,加入1×1012 cfu噬菌体抗体库,4℃结合4 h,洗脱,洗脱后的噬菌体感染大肠杆菌TG1扩增,经过3轮淘选,淘选得到的克隆再进行Phage-ELISA的鉴定,筛选得到阳性克隆。结果:纯化的MLAA-34作为抗原,经过在噬菌体抗体库中的3轮固相筛选,噬菌体的回收得到富集,洗脱的噬菌体产率显示回收率逐级增加,富集倍数约1000倍。最后一轮筛选后挑选出188个重组噬菌体克隆,His标签蛋白作为对照蛋白,应用Phage-ELISA筛选出33个阳性克隆。结论:利用得到的MLAA-34蛋白为目标抗原,对全人源噬菌体抗体库进行淘选,应用Phage-ELISA法挑选出和MLAA-34抗原结合力的阳性噬菌体,为抗MLAA-34抗体的制备奠定了基础。

棉花种子特异性启动子的克隆及表达载体构建

种子特异性表达启动子是植物种子基因工程改良的重要工具。Lea(Late embryogenesis abundant)蛋白是胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质,因此,其调控序列可能提供一个很好来源的种子特异性表达启动子。为研究植物Lea蛋白基因启动子在种子中的特异性表达,本研究通过PCR扩增,从亚洲棉(Gossypi-um arboreum L.)石系亚1号中克隆了Lea蛋白基因家族中D113基因上游1262 bp的调控序列和D34基因上游1445 bp的调控序列。DNA序列分析结果表明,克隆到的两个片段与已报道的Lea蛋白基因同一家族该基因的对应序列的相似性分别达到97.43%和94.27%。分别用限制性内切酶HindⅢ和xbaI双酶切重组质粒pGEMT-D和改造后的表达载体pBI121-T,分别回收pGEMT-D重组质粒中的小片段和pBI121-T植物表达载体中的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由D113基因启动子和D34基因启动子驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-D113、pBI121-D34,为外源基因在棉花种子中的定位表达研究奠定基础。

CD34的分子生物学研究进展

Civin等和Tindle等先后在1984年和1985年用人髓系细胞系KG—1a和KG—1制备了单克隆抗体(单抗)My10和BI.3C5。这两种单抗能与大多数骨髓来源的干、祖细胞,急性髓系和淋巴系白血病不成熟细胞以及血管内皮细胞上所表达的一种105—120kD膜蛋白特异结合。这种膜蛋白的表达与细胞分化阶段有关,而与系别(lineage)无关,1986年第三届国际人类白细胞分化抗原协作组会议将其命名为CD34。通过CD34对造血细胞进行分选及对CD34^+细胞的性能研究,已获可喜成果。然而CD34在有关细胞增殖、分化过程中起何作用。

miR-497和miR-34a在铂敏感和铂耐药卵巢上皮癌患者中的表达差异及机制研究

目的:探讨微小核糖核酸miR-497和miR-34a在铂敏感和铂耐药卵巢上皮癌(EOC)患者中表达的差异及机制。方法:选取2008年1月-2012年1月于我院妇产科行卵巢癌分期手术或肿瘤细胞减灭术的EOC患者72例,术后均行以铂类药物为基础的规范化疗,并进行随访(时间为2008年7月-2016年7月)。根据患者对铂类药物的敏感性将其分为铂敏感组(42例)和铂耐药组(30例)。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测两组患者肿瘤组织中miR-497和miR-34a的表达水平,并考察其与患者总生存时间的相关性;采用巢式降落式甲基化特异性聚合酶链反应法检测患者miR-497和miR-34a启动子区DNA甲基化水平,采用蛋白印迹法考察组蛋白H3第9位赖氨酸残基二甲基化(H3K9me2)水平,采用染色质免疫共沉淀法检测miR-497和miR-34a启动子区H3K9me2水平。结果:铂敏感组患者miR-497和miR-34a的表达水平均显著高于铂耐药组,差异均有统计学意义(P<0.05);72例患者的总生存期为(45.7±17.5)个月,与其miR-497和miR-34a表达水平呈正相关(r2分别为0.2714、0.3782,P<0.01)。铂耐药组患者miR-497和miR34a启动子区DNA甲基化水平均显著高于铂敏感组,且其启动子区H3K9me2水平也显著高于铂敏感组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);而铂耐药组患者H3K9me2水平虽略高于铂敏感组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:EOC患者肿瘤组织中miR-497和miR-34a的表达水平与铂化疗的敏感性及患者的生存时间有关,启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化可能是其表达变化的机制之一。

pIRES2-MLAA34-EGFP穿梭载体的构建及表达

目的构建p IRES2-MLAA34-EGFP重组质粒,并对其进行原核诱导表达。方法用RT-PCR的方法从U937细胞中提取MLAA-34基因,利用酶切、T4连接等分子生物学技术将MLAA-34目的基因克隆至p IRES2-EGFP表达载体中,经PCR、酶切等技术对构建的重组表达载体p IRES2-MLAA34-EGFP进行鉴定后,转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。结果扩增出MLAA-34全长基因1 014 bp,构建了p IRES2-MLAA34-EGFP重组质粒,经PCR和双酶切鉴定,与预期大小一致。重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。结论成功构建了p IRES2-MLAA34-EGFP重组质粒,并使其在大肠杆菌中高效表达。

miR-34b/c启动子区单核苷酸多态性对其转录调控的影响

[目的]研究miR-34b/c启动子区单核苷酸多态rs4938723(T/C)对其转录调控的影响。[方法]构建含有不同基因型miR-34b/c启动子区的报告基因表达载体pGL3-basic-miR34b/c-T和pGL3-basic-miR34b/c-C,分别与内参质粒SV40共转染于Hela、A549和CHO三种细胞后进行荧光素酶活性分析。[结果]pGL3-basic-miR34b/c-C等位基因组荧光素酶相对活性与pGL3-promoter-miR30C-T组等位基因相比,均有显著升高(P<0.01)。[结论]荧光素酶活性强弱间接反映了miRNA启动子区遗传变异对转录活性的影响,当miR-34b/c启动子区rs4938723位点为C时,可以更为有效地增加miR-34b/c的转录产物,从而在转录水平上调控miRNA的表达。