基于p38 MAPK/NF-κB/MLCK信号通路探讨半夏泻心汤修复肠黏膜屏障的作用机制

目的:探寻半夏泻心汤(BXD)在体内抑制肠道炎症反应及修复肠黏膜屏障的作用机制。方法:36只雌性SPF级SD大鼠随机分为空白组、模型组、西药组(美沙拉嗪组)以及半夏泻心汤低剂量组(BXD-低剂量组)、中剂量组(BXD-中剂量组)、高剂量组(BXD-高剂量组)。适应性喂养7 d后,除空白组外,其余各组大鼠自由饮用5%DSS 7 d构建溃疡性结肠炎大鼠模型,造模成功后,空白组与模型组灌胃生理盐水,西药组灌胃美沙拉嗪,0.054 g/d),半夏泻心汤低剂量组(2.205 g/kg)、中剂量组(4.41 g/kg)、高剂量组(8.82 g/kg)灌胃给予半夏泻心汤提取物,均给药15 d。采用疾病活动指数评估造模及药物治疗后大鼠的一般变化情况;苏木精-伊红(HE)染色法,确认结肠组织病变损伤程度;ELISA检测血清中炎性因子含量表达变化情况;qRT-PCR法、Western blot法检测p38 MAPK/NF-κB/MLCK/信号通路关键蛋白表达。结果:5%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎模型大鼠出现体质量减轻、腹泻、脓血便及结肠缩短,造模成功。BXD及美沙拉嗪给药后,大鼠的DAI评分出现不同程度的降低。HE结果显示美沙拉嗪及高剂量BXD给药后明显改善了DSS导致的大鼠结肠组织的病理情况。酶联免疫吸附实验结果提示,高剂量BXD及美沙拉嗪给药后可以显著抑制大鼠促炎因子的表达水平,从而达到抑制肠道炎症的治疗效果。Western blot和qPCR结果表明,BXD可通过调控MAPK、MLCK、NF-κB、Occludin的表达量修复肠黏膜屏障。结论:半夏泻心汤可降低肠黏膜通透性以及修复受损的肠黏膜,其机制可能是通过抑制p38 MAPK/NF-κB/MLCK信号通路实现的。

基于TLR4/NF-κB/MLCK通路探讨百合地黄汤治疗失眠伴肠道菌群失调小鼠的机制

目的基于TLR4/NF-κB/MLCK通路研究百合地黄汤对对氯苯丙氨酸(PCPA)及多因素刺激所致失眠伴肠道菌群失调小鼠的治疗作用及机制,为临床用药提供理论依据。方法将84只KM小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药物组(地西泮,1.38 mg·kg^(-1))、百合组(2.25 g·kg^(-1))、地黄组(2.25 g·kg^(-1))、百合地黄汤组(4.5 g·kg^(-1))。采用夹尾2 min、昼夜颠倒24 h、垫料潮湿24 h、45°鼠笼倾斜24 h、交替鼠笼24 h、禁食不禁水24 h、冷水浴3 min等多因素刺激4周结合PCPA腹腔注射2 d共同制备失眠小鼠模型。模型复制成功后,给予相应的药物治疗。采用高架十字迷宫系统观察小鼠的焦虑样行为;通过翻正反射实验观察睡眠潜伏期和睡眠持续时间;16s RNA测序法分析小鼠肠道菌群组成结构;液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测脑和结肠γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、色氨酸(Trp)、5-羟色氨酸(5-HTP)、5-羟色胺(5-HT)的浓度变化;免疫组织化学法检测结肠中闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)的表达情况;实时荧光定量PCR法(q RT-PCR)检测结肠组织中基因白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、ZO-1、Occludin、Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达情况;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测结肠上皮组织中蛋白TLR4、NF-κB、磷酸化-核因子κB(p-NF-κB)、MLCK、肌球蛋白轻链(MLC)和磷酸化-肌球蛋白轻链(p-MLC)表达情况。结果与正常组小鼠比较,模型组小鼠在高架十字迷宫中进入开臂区域的距离、在开臂区域停留的时间明显缩短(P<0.05);睡眠潜伏期明显延长、睡眠持续时间明显缩短(P<0.05);肠道菌群的丰富度、均匀度降低(P<0.01);脑内神经递质GABA、Trp、5-HTP、5-HT浓度明显降低(P<0.01),Glu浓度明显升高(P<0.01);结肠中GABA、Glu浓度明显降低(P<0.01),Trp、5-HTP、5-HT浓度明显升高(P<0.01);结肠组织炎性因子IL-1β、IL-6以及TNF-α基因表达水平明显升高(P<0.01),ZO-1、Occludin基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),通路中TLR4、NF-κB、MLCK基因表达水平明显升高(P<0.01),TLR4、p-NF-κB、MLCK、p-MLC蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组小鼠比较,百合地黄汤能够明显延长失眠小鼠在高架十字迷宫中进入开臂区域距离、在开臂区域停留的时间(P<0.05);明显缩短睡眠潜伏期、增加睡眠持续时间(P<0.05);肠道菌群的丰富度、均匀度升高(P<0.01);升高脑内神经递质GABA、Trp、5-HTP、5-HT浓度(P<0.05,P<0.01),降低Glu浓度(P<0.01);升高结肠中GABA、Glu浓度(P<0.01),降低Trp、5-HTP、5-HT浓度(P<0.05,P<0.01);下调IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达水平(P<0.01),上调ZO-1、Occludin基因和蛋白表达水平(P<0.01),下调通路中TLR4、NF-κB、MLCK基因表达水平和TLR4、p-NF-κB、MLCK、p-MLC蛋白表达水平(P<0.01)。结论百合地黄汤能够有效治疗失眠伴肠道菌群失调症状,其作用机制可能与调节脑和肠内神经递质紊乱、下调TLR4/NF-κB/MLCK信号通路表达、上调紧密连接蛋白表达、降低炎症反应,进而修复肠黏膜机械屏障有关。

从CaM-MLCK信号通路探究不同频率摩腹对脾虚家兔的手法效应

【目的】通过观察不同频率摩腹对脾虚家兔胃组织钙调蛋白(CaM)-肌球蛋白轻链激酶(MLCK)信号通路的影响,探析摩腹的手法效应。【方法】将72只家兔随机分为空白组、模型组、低频摩腹组(机械臂摩腹101~150次/min)、高频摩腹组(机械臂摩腹201~250次/min)、低频摩腹+抑制剂组[机械臂摩腹101~150次/min+腹腔注射MLCK抑制剂ML-92.0 mg·kg^(-1)]、高频摩腹+抑制剂组(机械臂摩腹201~250次/min+腹腔注射ML-92.0 mg·kg^(-1))。除空白组外,其余各组采用苦寒泻下法联合饥饱失常法构建脾虚家兔模型。干预结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察胃黏膜病理变化,实时定量聚合酶链反应(qPCR)法、Western Blot法分别对应检测胃小弯组织CaM、MLCK的mRNA、蛋白表达水平。【结果】(1)模型组出现明显脾虚症状,低频摩腹组、低频摩腹+抑制剂组、高频摩腹+抑制剂组家兔脾虚症状较模型组改善,而高频摩腹组脾虚症状较模型组加重。(2)与模型组比较,低频摩腹组、低频摩腹+抑制剂组、高频摩腹+抑制剂组家兔胃黏膜组织结构和形态均有所恢复,而高频摩腹组家兔胃黏膜组织结构和形态损伤均有所加重。(3)与空白组比较,模型组家兔胃小弯组织CaM、MLCK的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,低频摩腹组CaM、MLCK的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),高频摩腹组、低频摩腹+抑制剂组与高频摩腹+抑制剂组CaM、MLCK的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】低频率(101~150次/min)摩腹可通过上调CaM、MLCK mRNA和蛋白表达,促进脾虚家兔胃肠消化功能恢复,具有补的良性效应;相反,高频率(201~250次/min)摩腹一定程度上阻碍了脾虚家兔胃肠消化功能的恢复,具有泻的损益效应,其作用可能与抑制CaM、MLCK mRNA和蛋白表达有关。

急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障损伤、MLCK/p-MLC信号通路活性变化及其与抗菌肽的关系

目的观察急性胰腺炎(AP)大鼠肠黏膜屏障损伤情况和MLCK/p-MLC2信号通路活性变化,探讨MLCK/p-MLC2信号通路激活与抗菌肽的关系。方法将24只SD大鼠分为对照组6只和AP组18只,采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液进行AP造模,对照组仅翻动胰腺后复位。AP组于造模后6、12、24 h各取6只大鼠进行解剖和取材,对照组于造模后6 h取材。采用ELISA法检测血清淀粉酶、脂肪酶水平,HE染色法观察回肠组织病理改变,RT-qPCR法检测回肠组织潘氏细胞分泌的抗菌肽REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA表达水平,Western blotting法检测回肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1及MLCK/p-MLC2信号通路相关蛋白MLCK、p-MLC2蛋白表达水平。结果AP组造模后6、12、24 h血清淀粉酶、脂肪酶水平均高于对照组,其中12 h和24 h血清淀粉酶、脂肪酶水平高于6 h,且24 h高于12 h(P均<0.05)。对照组回肠黏膜完整,绒毛结构规整正常;AP组回肠黏膜出现不同程度的断裂缺失、间质水肿、炎性细胞浸润。AP组造模后6、12、24 h回肠组织病理学评分均高于对照组,且24 h高于6 h和12 h,12 h高于6 h(P均<0.05)。AP组造模后6、12、24 h回肠组织REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA及ZO-1、Claudin-1蛋白表达水平均低于对照组,且24 h低于6 h和12 h,12 h低于6 h(P均<0.05),造模后6、12、24 h回肠组织MLCK、p-MLC2蛋白表达水平均高于对照组,且12、24 h高于6 h,24 h高于12 h(P均<0.05)。AP组回肠组织MLCK蛋白表达水平与REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA水平呈负相关(r分别为-0.96、-0.95、-0.93,P均<0.05),p-MLC2蛋白表达水平与REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA水平亦呈负相关(r分别为-0.96、-0.94、-0.96,P均<0.05)。结论AP大鼠存在肠黏膜屏障损伤,MLCK/p-MLC2信号通路激活参与了AP肠黏膜屏障损伤的过程,该作用可能与潘氏细胞分泌抗菌肽减少相关。

不同频率摩腹对脾虚型功能性消化不良家兔胃肠动力的调控规律及其与CaM-MLCK信号通路相关性研究

目的观察不同频率摩腹对脾虚型功能性消化不良家兔胃肠动力的调控规律,以钙调蛋白—肌球蛋白轻链激酶(caImodulin-myosin light chain kinase,CaM-MLCK)信号通路为切入点探讨摩腹调控胃肠动力的作用机制。方法随机将60只健康成年新西兰家兔均分为空白组、模型组、低频摩腹治疗组、高频摩腹治疗组、低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组。除空白组外,其余各组家兔均造脾虚型功能性消化不良模型,空白组及模型组均不施加干预。治疗组采用人工智能机械臂以相应频率摩腹作用于各组家兔中脘、天枢穴(双),保持摩腹压力与方向一致,低频摩腹治疗组及低频摩腹+抑制剂组摩腹频率为101~150次/分钟,高频摩腹治疗组及高频摩腹+抑制剂组频率为201~250次/分钟,每只家兔每穴推5分钟,共计15分钟,每日1次。低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组均在每日摩腹治疗给家兔腹腔注射肌球蛋白轻链激酶抑制剂(ML 9 hydrochloride,ML-9),连续干预10天。干预结束后采用炭末灌胃法测定各组家兔小肠推进率,并测定各组家兔胃肠组织一氧化氮(nitric oxide,NO)、P物质(Substance P,SP)、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)、三磷酸肌醇(Inositol Triphosphate,IP3)及环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的含量。结果与空白组相比,模型组小肠推进率显著降低(P<0.01),胃NO含量显著升高(P<0.01),胃SP含量显著下降(P<0.01),胃、肠IP3无统计学差异(P>0.05),胃、肠ATP含量下降(P<0.05),胃、肠cAMP含量升高(P<0.05)。干预结束后,与模型组相比,低频摩腹治疗组、低频摩腹+抑制剂组及高频摩腹+抑制剂组小肠推进率均显著提高(P<0.01),高频摩腹治疗组无统计学差异(P>0.05);与模型组相比,低频摩腹治疗组胃NO含量显著下降(P<0.01),胃SP含量显著升高(P<0.01),肠IP3下降(P<0.05),胃、肠ATP含量升高(P<0.05),胃、肠cAMP含量下降(P<0.05);高频率摩腹治疗组胃SP含量升高(P<0.01),肠IP3含量下降(P<0.05),肠ATP含量升高(P<0.05),其余指标无统计学差异(P>0.05)。与低频摩腹治疗组比较,低频摩腹+抑制剂组胃NO含量升高(P<0.05),胃SP含量无统计学差异(P>0.05),肠IP3显著下降(P<0.01),胃、肠ATP含量显著下降(P<0.01),胃、肠cAMP含量升高(P>0.05);与高频摩腹治疗组比较,高频摩腹+抑制剂组胃NO含量升高(P<0.05),胃SP含量无统计学差异(P>0.05),肠IP3显著下降(P<0.01),胃、肠ATP含量下降(P<0.05),胃、肠cAMP含量升高(P<0.05)。结论摩腹对胃肠动力的影响存在频率—效应规律,摩腹在101~150次/分钟频率段时可显著促进胃肠动力,当频率超过200次/分时,摩腹对胃肠动力无改善作用,甚至有损害趋势。其作用机制可能是:(1)通过降低胃肠组织中NO及cAMP的含量,抑制cAMP/PKA途径及cGMP/PKG途径,减少对Ca 2+-CaM的竞争性消耗,从而促进上游CaM-MLCK信号通路中Ca 2+、Ca 2+-CaM与MLCK的结合。(2)当CaM-MLCK信号通路被阻断后,一方面,摩腹可通过提高家兔胃SP含量,发挥其促进胃肠动力的直接效应;另一方面,IP3的显著下降提示,阻断CaM-MLCK信号通路,可能增加IP3的消耗促使SOCE发生,从而改变胞内Ca 2+水平,激发Ca 2+介导的其它信号通路来调节胃肠动力。

通便汤对慢传输型便秘大鼠结肠c-kit和MLCK表达的影响

目的 探讨通便汤对慢传输型便秘(STC)大鼠结肠组织c-kit、MLCK蛋白及其他细胞因子的影响。方法 采用洛哌丁胺混悬液灌胃法复制STC大鼠模型,随机分为正常组、模型组、通便汤低、中、高剂量组和莫沙必利组。各组予以不同药物干预2周后,检测各组大鼠粪便含水率、小肠活性炭推进率;HE染色观察大鼠结肠病理学特征;酶联免疫法检测结肠一氧化氮(NO)、一氧化氮酶(NOS)的含量;免疫组化法检测结肠c-kit、MLCK的表达情况。结果 与正常组比较,模型组大鼠粪便质地干硬,含水率明显下降,小肠活性炭推进率显著下降(P<0.05),结肠组织正常结构被破坏,炎性细胞浸润,结肠组织NO和NOS含量明显上升, c-kit和MLCK蛋白表达明显下降(P<0.05);与模型组比较,通便汤各剂量组增加粪便含水率以及结肠肌层厚度和绒毛高度(P<0.05),提高小肠活性炭推进率,显著上调结肠组织c-kit和MLCK蛋白表达,同时降低结肠组织NO和NOS含量(P<0.05)。结论 通便汤能提高STC大鼠小肠活性炭推进率,增加粪便含水率,改善结肠病理形态,其作用机制可能与调节NO、NOS水平,上调结肠c-kit、MLCK蛋白表达有关。

参苓白术散调节ROCK/MLCK信号通路抗IBD的作用机制

目的探讨参苓白术散抗脂多糖(LPS)诱导的炎症性肠病(IBD)损伤的作用和机制。方法采用LPS(200μg·m L^(-1))造模,将细胞分为空白组(10%空白血清),模型组(10%空白血清+LPS),参苓白术散低、中、高剂量组(4%含药血清+LPS、8%含药血清+LPS、16%含药血清+LPS),FBS对照组(10%FBS+LPS)、Rho激酶(ROCK)阻断剂Y27632组(10μmol·L^(-1) Y27632+16%含药血清+LPS)、肌球蛋白亲链激酶(MLCK)阻断剂ML-7组(10μmol·L^(-1) ML-7+16%含药血清+LPS)。建立肠隐窝上皮细胞(IEC-6)与小鼠T淋巴细胞瘤细胞(Cyc-Tag)共培养体系。将共培养细胞接种于Transwell 12孔板中,采用Millipore-ERS电阻仪检测共培养体系下IEC-6细胞跨膜电阻值(TEER);采用Western Blotting法分别检测共培养体系中和Cyc-Tag单独培养下ROCK、MLCK、磷酸化ROCK(Pho-ROCK)及磷酸化MLC(Pho-MLC)蛋白的表达情况。结果共培养体系中,与空白组比较,模型组的IEC-6细胞TEER值显著下降(P<0.01),ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组比较,参苓白术散低、中、高剂量组及Y27632组、ML-7组的IEC-6细胞TEER值均显著升高(P<0.01),ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量均有明显下调(P<0.05,P<0.01)。Cyc-Tag细胞单独培养下,与空白组比较,模型组的ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组比较,参苓白术散低、中、高剂量组及Y27632组、ML-7组的ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量均有明显的下调(P<0.05,P<0.01)。结论参苓白术散含药血清对LPS诱导的IEC-6细胞损伤具有明显地抑制作用,可能与调节ROCK/MLCK信号通路及改善IEC-6细胞通透性有关。

“和解肝脾腹部推拿法”对非酒精性脂肪肝大鼠肠组织MLCK信号通路的影响

目的：观察和解肝脾腹部推拿法对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠肠黏膜组织MLCK信号通路的调控作用。方法：采用高脂饮食喂养10周建立NAFLD大鼠模型,再以和解肝脾腹部推拿法治疗4周后对比手法干预组和模型对照组体质量、肝湿重变化,用Western blot方法,检测手法干预前后,NAFLD大鼠模型肠黏膜组织MLCK及其介导的PMLC蛋白表达的变化,利用异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-Dextran）示踪法检测干预前后大鼠肠黏膜通透性变化。结果：与模型对照组相比较,手法干预组大鼠体质量及肝湿重明显降低（P 〈0. 05）;手法干预组肠黏膜组织MLCK蛋白表达及其介导的P-MLC蛋白表达较对照组明显降低（P 〈0. 05）;手法干预组大鼠肠袋外漏出FITC-Dextran含量与模型对照组相比明显降低（P 〈0. 05）。结论：和解肝脾腹部推拿法可降低NAFLD大鼠体质量与肝湿重,其通过调控肠组织MLCK信号通路,改善肠上皮屏障功能,降低肠道黏膜的通透性,有利于阻断LPS等毒素对肝脏的侵袭,此可能为和解肝脾腹部推拿法治疗NAFLD的作用机制。

聚合酶链反应在MLCK表达载体构建中的应用

用聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）方法扩增出含有ＳａｌⅠ位点和转录起始点ＡＴＧ的肌球蛋白轻链激酶（ｍｙｏｓｉｎＬｉｇｈｔｃｈａｉｎｋｉ－ｎａｓｅ，ＭＬＣＫ）ｃＤＮＡ片段，并插入质粒ｐＢＫｒｓｖ中，构建成能在宿主细胞中表达的表达载体，并通过酶切图谱、ＳａｌⅠ位点ＤＮＡ序列分析得到证实。为进一步研究ＭＬＣＫ的表达奠定基础。

清开灵对小鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤MLCK基因转录的影响

目的:研究清开灵对小鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤MLCK基因转录的影响。方法:细胞分为正常对照组(有糖Earle液)、模型组(缺氧缺糖模拟缺血:无糖Earle液,37℃,5%CO2,1%O2培养24 h)、清开灵低、中、高浓度组(缺氧缺塘+清开灵1%、2%、4%),在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后经MTT比色法检测细胞活力、荧光定时定量PCR检测MLCK基因转录。结果:缺氧缺糖24 h后微血管内皮细胞活性降低(P<0.05)、MLCK基因转录被抑制(P<0.05);清开灵1%、2%、4%组均抑制了缺糖缺氧条件下微血管内皮细胞活性的降低(P<0.05),清开灵4%组降低MLCK的表达(P<0.05)。结论:缺糖缺氧条件下微血管内皮细胞活性降低。清开灵通过抑制MLCK的表达,恢复BBB的部分屏障功能。

加味柴芍六君颗粒对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜屏障及MEK-ERK-MLCK通路的影响

目的探究加味柴芍六君颗粒对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜屏障及丝裂原活化蛋白激酶激酶-细胞外信号调节蛋白激酶-肌球蛋白轻链激酶(MEK-ERK-MLCK)通路的影响。方法将60只大鼠随机分为对照组,模型组,加味柴芍六君颗粒低(0.25 g/ml)、中(0.50 g/ml)、高剂量(1.00 g/ml)治疗组,每组12只。以三硝基苯磺酸(TNBS)诱导造模,成功后加味柴芍六君颗粒各剂量治疗组大鼠以加味柴芍六君颗粒溶液灌胃治疗5 w,对照组和模型组大鼠以相同剂量生理盐水同样灌胃5 w,然后观察各组大鼠体重变化、大便性状、便血情况进行疾病活动指数(DAI)评分,苏木素-伊红(HE)染色法观察各组大鼠结肠组织病理学变化,进行组织学(HI)评分,髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒检测结肠中MPO的水平,实时荧光定量(qRT)-PCR检测MEK、ERK、MLCK mRNA的表达,Western印迹法检测MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白的表达。结果与对照组相比,模型组大鼠DAI评分,HI评分,MPO水平,MEK、ERK、MLCK mRNA表达,MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表达均明显升高(P<0.05);与模型组相比,加味柴芍六君颗粒各剂量治疗组大鼠DAI评分,HI评分,MPO水平,MEK、ERK、MLCK mRNA表达,MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表达均明显降低且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论加味柴芍六君颗粒可以修复溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障,分子机制可能与抑制MEK-ERK-MLCK通路表达有关。

MLCK和ROCK对细胞骨架和细胞行为的影响

肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)和ROCK/ROK/Rho激酶(Rho kinase,ROCK)是肌细胞和非肌细胞中调节肌球蛋白轻链磷酸化的两种重要激酶,肌球蛋白轻链磷酸化调节肌球蛋白的收缩参与了诸如细胞运动、粘附、组织修复和癌症转移和疾病发生等重要的生命活动。在这些重要的生命活动中,同样是催化肌球蛋白磷酸化的这两种激酶,MLCK和ROCK定位在不同的细胞区域,以不同的作用方式通过对细胞骨架的影响实现对细胞功能的精细调控。

四神丸对脾肾阳虚泄泻大鼠胃窦组织Ghrelin-CaM-MLCK信号通路的影响

目的观察四神丸对脾肾阳虚型泄泻模型大鼠胃窦组织Ghrelin-Ca M-MLCK信号通路的影响,探讨其作用机制。方法采用灌服腺嘌呤和番泻叶水煎剂制作脾肾阳虚型泄泻大鼠模型。将72只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和四神丸高、中、低剂量组,每组12只。各给药组给予相应药物灌胃,连续14 d,免疫组化和Western blot分别检测胃窦组织脑肠肽胃促生长素(Ghrelin)及其受体(GHSR)、钙调素(Ca M)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的蛋白表达。结果模型组大鼠胃窦组织Ghrelin、GHSR、Ca M和MLCK蛋白表达均较正常组明显升高(P<0.01);各给药组上述指标蛋白表达均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01),且以四神丸高剂量组最为明显。结论四神丸对脾肾阳虚泄泻模型大鼠的作用可能与调节Ghrelin-Ca M-MLCK信号通路指标的蛋白表达有关。

柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠模型胃肠平滑肌细胞MLCK表达的影响

目的:研究柴胡疏肝散汤剂对胃肠功能紊乱大鼠胃肠平滑肌细胞肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达的影响。方法:将8周龄SD大鼠按随机数字表法分为sham组(对照组)、FGID组(模型组)、sham+柴胡疏肝散组、FGID+柴胡疏肝散组4组各20只。利用腹腔注射利血平建立大鼠胃肠功能紊乱动物模型,利用Real-Time PCR、western Blot和组织免疫荧光技术检测柴胡疏肝散汤剂对胃肠功能紊乱大鼠胃肠平滑肌细胞MLCK表达的影响。结果:Real-Time PCR、Westeron Blot和组织免疫荧光显示FGID组大鼠胃肠平滑肌细胞内MLCK表达量显著减少,经柴胡疏肝散干预后MLCK表达显著上升。结论:柴胡疏肝散汤剂能提高胃肠功能紊乱大鼠胃肠平滑肌细胞内MLCK的表达。

开胃进食汤超微颗粒对胃肠平滑肌细胞MLCK表达的影响

目的研究开胃进食汤超微配方颗粒对脾虚大鼠胃肠平滑肌细胞肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达的影响,探求其对大鼠胃肠动力调节作用的机制。方法采用利血平脾虚模型,将大鼠随机分为正常组、模型组、开胃进食汤超微配方颗粒(超微)组、传统汤剂(煎剂)组和健胃消食片对照(健胃)组,用免疫组化半定量分析MLCK的表达情况,同时观察药物对其影响。结果模型组大鼠胃窦平滑肌内MLCK表达明显减少,空肠平滑肌内明显增强,与正常组比较差异具有统计学意义(P<0.05);健胃组、煎剂组和超微组胃窦平滑肌内MLCK表达较模型组增强,差异具有统计学意义(P<0.05),煎剂组和超微组空肠平滑肌内MLCK表达低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论开胃进食汤超微配方颗粒能促进胃窦平滑肌收缩和空肠平滑肌舒张,可能与其提高胃窦平滑肌组织和降低空肠平滑肌组织内MLCK水平表达有关。

凝血酶信号传导过程中PI3-K与MLCK激酶的作用

本研究比较凝血酶受体活化过程中不同浓度的wortmannin对血小板聚集率以及血小板膜表面活化标记物糖蛋白GPIb表达的影响,探讨脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)与肌球蛋白轻链激酶(MLCK)在凝血酶信号传递机制中的作用。分别以凝血酶受体活化肽PAR1-AP(SFLLRN)与PAR4-AP(AYPGKF)诱导血小板活化。检测100nmol/L wortmannin(抑制PI3-K)与10μmol/L wortmannin(抑制MLCK)作用过程中血小板聚集与血小板膜表面糖蛋白GPIb的改变。结果显示:wortmannin作用对两类凝血酶受体诱导血小板活化的过程均有不同程度的影响。100nmol/L的wortmannin部分抑制PAR1-AP引起的血小板聚集,对PAR4-AP诱导的聚集过程没有影响;10μmol/Lwortmannin明显抑制两类PAR肽引起的血小板活化,抑制程度达到60%-80%,仅出现少部分聚集。流式细胞仪检测显示,GPIbα的动态分布过程中100nmol/L wortmannin能部份抑制GPIbα向胞内移动,PAR1-AP刺激后5分钟内wort-mannin起效明显(1、2、5分钟p<0.05),对PAR4-AP的反应则稍延迟,在2到10分钟有意义(2、5、10分钟p<0.05)。10μmol/L wortmannin对整个PAR活化过程中的GPIbα逆转没有任何影响,只对PAR1刺激过程中GPIbα的恢复起作用,延缓GPIbα重返血小板膜表面的进程;而PAR4-AP作用后各时间段GPIbα的动态分布不受10μmol/L wortmannin任何影响。结论:PI3-K与MLCK在凝血酶受体的活化过程中作用不同,PI3-K在GPIbα内转的短暂过程中起着重要作用;而MLCK磷酸化仅仅对PAR1受体介导的GPIbα回复起促进作用。

ATRA通过ERK/MAPK通路调控AS兔心脏MLCK的表达

目的研究全反式维甲酸(ATRA)通过信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)通路调控动脉粥样硬化(AS)模型兔心脏中肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达。方法普通新西兰大耳朵白兔随机分为正常组、模型组、ATRA组,正常组给予普通饲料喂养,模型组和ATRA组给予高脂饲料(普通饲料+1%胆固醇+5%猪油)喂养,并且ATRA组同时给予ATRA灌胃5 mg/(kg·d)。12周后,取动脉和心脏组织,油红染色分析动脉壁斑块形成情况;HE染色和Masson染色观察心肌组织形态学变化,免疫组织化学染色观察心脏中MLCK的表达;Western blot法检测各组MLCK蛋白和ERK蛋白磷酸化水平。体外培养H9c2心肌细胞,分为正常组、模型组、ATRA组、ERK/MAPK选择性抑制剂(PD)组。Western blot法检测各组MLCK蛋白的表达水平。结果 12周以后,AS兔模型建立成功。与正常组比较,模型组动脉壁形成大量粥样斑块;HE染色结果显示模型组心肌组织出现严重的紊乱情况;Masson染色结果显示模型组心肌组织发生明显胶原纤维堆积;免疫组化结果显示模型组心肌组织中MLCK表达量增多;而给予ATRA以后,心肌组织紊乱情况得到改善,胶原纤维堆积得到缓解,MLCK表达量和ERK磷酸化水平均有所降低。并且模型组细胞中MLCK蛋白表达升高,给予ATRA和PD98059后,MLCK表达降低。结论 ATRA可能通过ERK/MAPK通路降低模型兔心肌细胞MLCK的表达。

MLCK在重症急性胰腺炎大鼠胰腺的表达及作用

目的:探讨肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)在重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠胰腺组织的表达和作用.方法:56只♂SD大鼠,随机分为对照组(C组)和实验组(S组).以4%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射建立SAP大鼠模型,于造模后6、12、24、48 h分批解剖大鼠.动态测定各时点血清淀粉酶(amylase,AMY)水平;光镜下观察胰腺大体及组织学表现;电镜下观察胰腺组织超微结构及紧密连接(tight junction,TJ);免疫组织化学法测定胰腺组织MLCK定位和表达;ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factorα,TNF-α)含量.结果:与对照组相比,S组AMY浓度显著升高(P<0.05);S组胰腺病理学评分显著升高(P<0.05);S组胰腺超微结构破坏明显;T J显著增宽;S组胰腺MLCK阳性表达于胞浆内,平均光密度显著升高(P<0.05);S组血清TNF-α浓度显著升高(P<0.05);胰腺MLCK平均光密度与病理评分、血清TNF-α的Pearson相关分析分别为:r1=0.804,r2=0.796,均P<0.05.结论:SAP大鼠胰腺组织MLCK蛋白、血清TNF-α表达上调,可能通过其调节细胞紧密连接完整性,其可能与疾病严重程度相关,参与急性胰腺炎发病机制.

不同剂量黄连对脾虚大鼠胃黏膜病理形态及CaM/MLCK mRNA表达水平的影响

目的:观察不同剂量黄连水煎液对脾虚大鼠胃黏膜病理变化和胃窦平滑肌组织CaM/MLCKmRNA表达水平的影响。方法:采用利血平腹腔注射法建立脾虚证大鼠模型,共造模14 d。受试大鼠随机分为6组,即空白对照组,模型组,多潘立酮组,黄连高、中、低剂量组,每组10只。除空白对照组外,其余各组采用利血平腹腔注射法建立脾虚证大鼠模型。造模结束后,黄连各组灌服不同剂量黄连水煎液(给药剂量分别为5 g·kg^(-1),2.5 g·kg^(-1),1.25 g·kg^(-1)),多潘立酮组灌服多潘立酮水溶液,正常组和模型组则用等体积生理盐水对照灌胃,持续14 d。HE黏膜染色观察胃黏膜病理变化,Real-time PCR法检测大鼠胃窦平滑肌组织CaM、MLCK mRNA表达水平。结果:脾虚模型组胃黏膜萎缩变薄,皱襞低平,出现胃黏膜中断,水肿明显,脂肪及胶原纤维组织增生。黄连高、中、低剂量组胃黏膜中段、水肿等病理现象均不同程度减轻,脂肪及胶原纤维组织增生也减少。与空白对照组比较,模型组胃窦平滑肌组织CaM和MLCK mRNA含量均显著下降(P<0.001);与模型组比较,黄连高、中、低剂量组CaM mRNA含量均显著升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,多潘立酮组、黄连高、中剂量组MLCK mRNA含量均显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论:一定剂量黄连可能通过保护胃黏膜,增加胃黏膜组织CaM/MLCK mRNA的表达调控"Ca^(2+)-CaM-MLCK"实现"健胃"作用。

基于MLCK信号通路探讨一指禅推法对脾虚家兔胃肠传输功能的影响

目的观察一指禅推法对脾虚家兔胃肠传输功能的影响,从肌球蛋白轻链激酶(MLCK)信号通路角度探讨一指禅推法调节胃肠动力的作用机制。方法取成年新西兰兔40只,随机分为K组(空白组)、P组(模型组)、I-1组(频率101~150次/min)、I-2组(频率201~250次/min),每组10只,造脾虚模型。I-1组和I-2组在中脘、天枢(双)予以不同频率一指禅推法干预治疗,每日手法治疗后均进行腹腔注射Akt激酶选择性强效抑制剂(ML-9),其余组不采取干预措施。干预结束后采用炭末灌胃法对各组家兔进行小肠推进率的测定,评估一指禅推法对家兔胃肠传输功能的影响。结果与K组比较,P组家兔小肠推进率显著降低(P<0.05);与P组比较,I-1组和I-2组家兔小肠推进率均明显提高(P<0.01);I-1组与I-2组比较,I-1组小肠推进率高于I-2组(P<0.05)。结论当胃肠平滑肌细胞内的MLCK被抑制后,一指禅推法仍能明显改善脾虚家兔的胃肠传输功能,其产生效应的机制可能是通过多通路、多靶点发挥作用。