基于TLR4/NF-κB/MLCK通路探讨百合地黄汤治疗失眠伴肠道菌群失调小鼠的机制

目的基于TLR4/NF-κB/MLCK通路研究百合地黄汤对对氯苯丙氨酸(PCPA)及多因素刺激所致失眠伴肠道菌群失调小鼠的治疗作用及机制,为临床用药提供理论依据。方法将84只KM小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药物组(地西泮,1.38 mg·kg^(-1))、百合组(2.25 g·kg^(-1))、地黄组(2.25 g·kg^(-1))、百合地黄汤组(4.5 g·kg^(-1))。采用夹尾2 min、昼夜颠倒24 h、垫料潮湿24 h、45°鼠笼倾斜24 h、交替鼠笼24 h、禁食不禁水24 h、冷水浴3 min等多因素刺激4周结合PCPA腹腔注射2 d共同制备失眠小鼠模型。模型复制成功后,给予相应的药物治疗。采用高架十字迷宫系统观察小鼠的焦虑样行为;通过翻正反射实验观察睡眠潜伏期和睡眠持续时间;16s RNA测序法分析小鼠肠道菌群组成结构;液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测脑和结肠γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、色氨酸(Trp)、5-羟色氨酸(5-HTP)、5-羟色胺(5-HT)的浓度变化;免疫组织化学法检测结肠中闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)的表达情况;实时荧光定量PCR法(q RT-PCR)检测结肠组织中基因白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、ZO-1、Occludin、Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达情况;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测结肠上皮组织中蛋白TLR4、NF-κB、磷酸化-核因子κB(p-NF-κB)、MLCK、肌球蛋白轻链(MLC)和磷酸化-肌球蛋白轻链(p-MLC)表达情况。结果与正常组小鼠比较,模型组小鼠在高架十字迷宫中进入开臂区域的距离、在开臂区域停留的时间明显缩短(P<0.05);睡眠潜伏期明显延长、睡眠持续时间明显缩短(P<0.05);肠道菌群的丰富度、均匀度降低(P<0.01);脑内神经递质GABA、Trp、5-HTP、5-HT浓度明显降低(P<0.01),Glu浓度明显升高(P<0.01);结肠中GABA、Glu浓度明显降低(P<0.01),Trp、5-HTP、5-HT浓度明显升高(P<0.01);结肠组织炎性因子IL-1β、IL-6以及TNF-α基因表达水平明显升高(P<0.01),ZO-1、Occludin基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),通路中TLR4、NF-κB、MLCK基因表达水平明显升高(P<0.01),TLR4、p-NF-κB、MLCK、p-MLC蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组小鼠比较,百合地黄汤能够明显延长失眠小鼠在高架十字迷宫中进入开臂区域距离、在开臂区域停留的时间(P<0.05);明显缩短睡眠潜伏期、增加睡眠持续时间(P<0.05);肠道菌群的丰富度、均匀度升高(P<0.01);升高脑内神经递质GABA、Trp、5-HTP、5-HT浓度(P<0.05,P<0.01),降低Glu浓度(P<0.01);升高结肠中GABA、Glu浓度(P<0.01),降低Trp、5-HTP、5-HT浓度(P<0.05,P<0.01);下调IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达水平(P<0.01),上调ZO-1、Occludin基因和蛋白表达水平(P<0.01),下调通路中TLR4、NF-κB、MLCK基因表达水平和TLR4、p-NF-κB、MLCK、p-MLC蛋白表达水平(P<0.01)。结论百合地黄汤能够有效治疗失眠伴肠道菌群失调症状,其作用机制可能与调节脑和肠内神经递质紊乱、下调TLR4/NF-κB/MLCK信号通路表达、上调紧密连接蛋白表达、降低炎症反应,进而修复肠黏膜机械屏障有关。

急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障损伤、MLCK/p-MLC信号通路活性变化及其与抗菌肽的关系

目的观察急性胰腺炎(AP)大鼠肠黏膜屏障损伤情况和MLCK/p-MLC2信号通路活性变化,探讨MLCK/p-MLC2信号通路激活与抗菌肽的关系。方法将24只SD大鼠分为对照组6只和AP组18只,采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液进行AP造模,对照组仅翻动胰腺后复位。AP组于造模后6、12、24 h各取6只大鼠进行解剖和取材,对照组于造模后6 h取材。采用ELISA法检测血清淀粉酶、脂肪酶水平,HE染色法观察回肠组织病理改变,RT-qPCR法检测回肠组织潘氏细胞分泌的抗菌肽REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA表达水平,Western blotting法检测回肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1及MLCK/p-MLC2信号通路相关蛋白MLCK、p-MLC2蛋白表达水平。结果AP组造模后6、12、24 h血清淀粉酶、脂肪酶水平均高于对照组,其中12 h和24 h血清淀粉酶、脂肪酶水平高于6 h,且24 h高于12 h(P均<0.05)。对照组回肠黏膜完整,绒毛结构规整正常;AP组回肠黏膜出现不同程度的断裂缺失、间质水肿、炎性细胞浸润。AP组造模后6、12、24 h回肠组织病理学评分均高于对照组,且24 h高于6 h和12 h,12 h高于6 h(P均<0.05)。AP组造模后6、12、24 h回肠组织REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA及ZO-1、Claudin-1蛋白表达水平均低于对照组,且24 h低于6 h和12 h,12 h低于6 h(P均<0.05),造模后6、12、24 h回肠组织MLCK、p-MLC2蛋白表达水平均高于对照组,且12、24 h高于6 h,24 h高于12 h(P均<0.05)。AP组回肠组织MLCK蛋白表达水平与REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA水平呈负相关(r分别为-0.96、-0.95、-0.93,P均<0.05),p-MLC2蛋白表达水平与REG3γ、α-防御素5、溶菌酶mRNA水平亦呈负相关(r分别为-0.96、-0.94、-0.96,P均<0.05)。结论AP大鼠存在肠黏膜屏障损伤,MLCK/p-MLC2信号通路激活参与了AP肠黏膜屏障损伤的过程,该作用可能与潘氏细胞分泌抗菌肽减少相关。

参苓白术散调节ROCK/MLCK信号通路抗IBD的作用机制

目的探讨参苓白术散抗脂多糖(LPS)诱导的炎症性肠病(IBD)损伤的作用和机制。方法采用LPS(200μg·m L^(-1))造模,将细胞分为空白组(10%空白血清),模型组(10%空白血清+LPS),参苓白术散低、中、高剂量组(4%含药血清+LPS、8%含药血清+LPS、16%含药血清+LPS),FBS对照组(10%FBS+LPS)、Rho激酶(ROCK)阻断剂Y27632组(10μmol·L^(-1) Y27632+16%含药血清+LPS)、肌球蛋白亲链激酶(MLCK)阻断剂ML-7组(10μmol·L^(-1) ML-7+16%含药血清+LPS)。建立肠隐窝上皮细胞(IEC-6)与小鼠T淋巴细胞瘤细胞(Cyc-Tag)共培养体系。将共培养细胞接种于Transwell 12孔板中,采用Millipore-ERS电阻仪检测共培养体系下IEC-6细胞跨膜电阻值(TEER);采用Western Blotting法分别检测共培养体系中和Cyc-Tag单独培养下ROCK、MLCK、磷酸化ROCK(Pho-ROCK)及磷酸化MLC(Pho-MLC)蛋白的表达情况。结果共培养体系中,与空白组比较,模型组的IEC-6细胞TEER值显著下降(P<0.01),ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组比较,参苓白术散低、中、高剂量组及Y27632组、ML-7组的IEC-6细胞TEER值均显著升高(P<0.01),ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量均有明显下调(P<0.05,P<0.01)。Cyc-Tag细胞单独培养下,与空白组比较,模型组的ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量显著增加(P<0.01);与模型组比较,参苓白术散低、中、高剂量组及Y27632组、ML-7组的ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量均有明显的下调(P<0.05,P<0.01)。结论参苓白术散含药血清对LPS诱导的IEC-6细胞损伤具有明显地抑制作用,可能与调节ROCK/MLCK信号通路及改善IEC-6细胞通透性有关。

“和解肝脾腹部推拿法”对非酒精性脂肪肝大鼠肠组织MLCK信号通路的影响

目的：观察和解肝脾腹部推拿法对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠肠黏膜组织MLCK信号通路的调控作用。方法：采用高脂饮食喂养10周建立NAFLD大鼠模型,再以和解肝脾腹部推拿法治疗4周后对比手法干预组和模型对照组体质量、肝湿重变化,用Western blot方法,检测手法干预前后,NAFLD大鼠模型肠黏膜组织MLCK及其介导的PMLC蛋白表达的变化,利用异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-Dextran）示踪法检测干预前后大鼠肠黏膜通透性变化。结果：与模型对照组相比较,手法干预组大鼠体质量及肝湿重明显降低（P 〈0. 05）;手法干预组肠黏膜组织MLCK蛋白表达及其介导的P-MLC蛋白表达较对照组明显降低（P 〈0. 05）;手法干预组大鼠肠袋外漏出FITC-Dextran含量与模型对照组相比明显降低（P 〈0. 05）。结论：和解肝脾腹部推拿法可降低NAFLD大鼠体质量与肝湿重,其通过调控肠组织MLCK信号通路,改善肠上皮屏障功能,降低肠道黏膜的通透性,有利于阻断LPS等毒素对肝脏的侵袭,此可能为和解肝脾腹部推拿法治疗NAFLD的作用机制。

基于MLCK信号通路探讨一指禅推法对脾虚家兔胃肠传输功能的影响

目的观察一指禅推法对脾虚家兔胃肠传输功能的影响,从肌球蛋白轻链激酶(MLCK)信号通路角度探讨一指禅推法调节胃肠动力的作用机制。方法取成年新西兰兔40只,随机分为K组(空白组)、P组(模型组)、I-1组(频率101~150次/min)、I-2组(频率201~250次/min),每组10只,造脾虚模型。I-1组和I-2组在中脘、天枢(双)予以不同频率一指禅推法干预治疗,每日手法治疗后均进行腹腔注射Akt激酶选择性强效抑制剂(ML-9),其余组不采取干预措施。干预结束后采用炭末灌胃法对各组家兔进行小肠推进率的测定,评估一指禅推法对家兔胃肠传输功能的影响。结果与K组比较,P组家兔小肠推进率显著降低(P<0.05);与P组比较,I-1组和I-2组家兔小肠推进率均明显提高(P<0.01);I-1组与I-2组比较,I-1组小肠推进率高于I-2组(P<0.05)。结论当胃肠平滑肌细胞内的MLCK被抑制后,一指禅推法仍能明显改善脾虚家兔的胃肠传输功能,其产生效应的机制可能是通过多通路、多靶点发挥作用。

白术内酯Ⅰ通过SGLT1/NHE3通路治疗腹泻的机制研究

目的:探讨白术内酯Ⅰ通过SGLT1/NHE3通路治疗腹泻的机制。方法:Caco-2细胞建立体外肠道吸收模型,将细胞分别设为空白对照组、抑制剂(SGLT1抑制剂根皮苷、P38MAPK抑制剂SB203580、Ezrin抑制剂NSC668394)组、白术内酯Ⅰ组、白术内酯Ⅰ+抑制剂组,采用2-NBDG测定白术内酯Ⅰ对Caco-2细胞葡萄糖摄取的影响;Western Blot法检测SGLT1、p-P38MAPK、p-MAPKAPK2、p-AKT2、p-Ezrin、MLCK、p-MLC、NHE3等蛋白表达,荧光定量PCR检测SGLT1、MLCK、NHE3 mRNA表达。结果:白术内酯Ⅰ促进Caco-2细胞葡萄糖摄取,上调SGLT1、NHE3、MLCK的表达;此外,白术内酯Ⅰ增加了MLCK和P38MAPK/Ezrin信号通路中的蛋白磷酸化。结论:白术内酯Ⅰ可激活SGLT1促进Caco-2细胞葡萄糖摄取,通过P38MAPK/Ezrin信号通路上调其下游靶点NHE3和MLCK促进水钠吸收是其治疗腹泻的机制之一。

香砂六君子汤对脾胃虚弱型功能性消化不良大鼠的干预机制研究

目的 探讨香砂六君子汤对脾胃虚弱型功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)大鼠的干预机制。方法 将60只SPF级雄性SD乳鼠随机分为空白组(n=10)和造模组(n=50),造模组大鼠采用综合造模法(碘乙酰胺灌服+游泳力竭+饥饱失常)复制脾胃虚弱型FD大鼠模型。模型复制成功后将造模组大鼠随机分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组,共5组,每组10只。空白组和模型组大鼠给予10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃,阳性对照组给予1.35 mg/(kg·d)莫沙必利药剂灌胃,香砂六君子汤高、中、低剂量组分别给予12、6、3 g/(kg·d)香砂六君子汤汤剂灌胃,持续干预14 d。造模和给药前后观察大鼠一般状况,测定大鼠体重、3 h进食量。给药干预结束后,测定大鼠胃排空率、肠推进率,采用苏木素-伊红染色观察胃组织病理改变,采用生化试剂盒测定大鼠胃组织匀浆液中Mg2+-ATP酶含量,采用蛋白免疫印迹法检测胃组织中CaM、MLCK、p-MLC20蛋白表达水平。结果 与空白组比较,模型组大鼠毛发枯乱、倦懒怠动、行动缓迟,一般状况评分显著降低,体重、3 h进食量、胃排空率及肠推进率均显著下降(P<0.05);胃组织病理未见明显异常;胃组织中Mg2+-ATP酶含量减少,胃组织中CaM、MLCK、p-MLC20蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,高、中剂量给药组大鼠一般状况评分显著提升,体重、3 h进食量以及胃排空率显著增加(P<0.05);胃组织病理未见明显差异;胃组织中Mg2+-ATP酶含量显著增加,胃组织中CaM、MLCK、p-MLC20蛋白表达水平显著升高(P<0.05),上述指标香砂六君子汤组干预作用呈剂量依赖性。结论 香砂六君子汤能够有效改善脾胃虚弱型FD大鼠一般状况及胃动力,作用机制可能与其激活胃组织中CaM/MLCK/MLC20通路调控平滑肌舒缩,促进胃动力有关。

从小肠炭末推进率观察摩法的补泻效应

目的通过小肠炭末推进率观察不同频率摩法的补泻效应;以MLCK为主要信号通路作为切入点,探析摩法治疗脾虚型家兔的作用机制。方法将72只家兔随机分为空白组(K组)、模型组(P组)、摩法低频组(A组)、摩法高频组(B组)、抑制剂组1(I-1组)、抑制剂组2(I-2组)。除K组,其余组进行造模。采用机械臂对A组、B组、I-1组、I-2组进行10 d的摩法干预,A组、I-1组摩法频率为每分钟101~150次;B组、I-2组摩法频率为每分钟201~250次。I-1组、I-2组在手法干预前予腹腔注射ML-9(2 mg·kg^(-1)),采用炭末灌胃法测定家兔小肠炭末推进率。结果 K组、A组、I-1组、I-2组小肠推进率均优于P组,差异有统计学意义(P<0.05);B组与K组存在统计学差异(P<0.05)。结论每分钟101~150次频率摩法能促进脾虚家兔消化功能恢复,而每分钟201~250次频率摩法无促进功能恢复;当MLCK通路被阻断后,摩法仍能明显影响脾虚家兔的胃肠传输功能,其产生效应的机制可能是通过其他通路和靶点发挥作用。

罗哌卡因对胃癌SGC-7901细胞生物学行为及ROCK/MLC信号通路的影响

目的探讨罗哌卡因对胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭、凋亡及Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)/肌球蛋白轻链(MLC)信号通路的影响。方法设SGC-7901细胞组、5-氟尿嘧啶组(20μg/ml)、罗哌卡因低、高剂量组(50、100μg/ml),培养72 h。分别采用细胞计数试剂盒(CCK)-8法、Transwell小室、流式细胞仪检测胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭、凋亡情况;实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)及Western印迹测定胃癌SGC-7901细胞ROCK、MLC mRNA及蛋白表达水平。结果与SGC-7901细胞组比较,5-氟尿嘧啶组、罗哌卡因低、高剂量组光密度(OD)值、存活率、侵袭细胞数、ROCK、MLC mRNA和蛋白表达水平明显降低,凋亡率明显升高(P<0.05);与5-氟尿嘧啶组比较,罗哌卡因低剂量组OD值、存活率、侵袭细胞数、ROCK、MLC mRNA和蛋白表达水平明显升高,凋亡率明显降低(P<0.05);罗哌卡因高剂量组与5-氟尿嘧啶组上述指标差异无统计学意义(P>0.05);与罗哌卡因低剂量组比较,罗哌卡因高剂量组OD值、存活率、侵袭细胞数、ROCK、MLC mRNA和蛋白表达水平明显降低,凋亡率明显升高(P<0.05)。结论罗哌卡因能使胃癌SGC-7901细胞增殖和侵袭减弱,凋亡加速,抑制ROCK/MLC信号通路活性可能是其作用机制。

米诺环素促进PC12细胞氧糖剥夺/复氧后神经突生长及机制研究

目的观察米诺环素对PC12细胞氧糖剥夺/复氧损伤后神经突生长的影响。方法将体外培养的PC12细胞随机分为正常组、模型组(OGD/R)、米诺环素组(1μmol/L,MC+OGD/R)和MLCP抑制剂组(1nmol/L Calyculin A)。以氧糖剥夺6h/复氧模拟体外脑缺血再灌注损伤对PC12细胞进行处理,复氧24h后采用CCK-8法测定PC12细胞的存活率,Western blot法测定肌球蛋白轻链(MLC)及磷酸化肌球蛋白轻链(pMLC)的表达,细胞免疫荧光染色标记PC12细胞轴突,荧光显微镜下观察轴突长度。结果米诺环素组PC12细胞存活率明显高于模型组[(77.7±3.3)%vs.(48.6±3.2)%,P<0.05],氧糖剥夺/复氧损伤引起PC12细胞神经突回缩,米诺环素组PC12细胞神经突平均长度较模型组增加[(44.79±5.36)μmvs.(15.75±5.92)μm,P<0.05],MLCP抑制剂组能阻断米诺环素的轴突生长促进作用。此外,模型组PC12细胞MLC磷酸水平明显高于米诺环素组[1.02±0.12 vs.0.33±0.07,P<0.05]。结论米诺环素通过激活MLCP/MLC信号通路,使MLC磷酸化水平下降,促进PC12细胞氧糖剥夺/复氧后神经突的生长。