实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病患者MLL-AF9融合基因表达的预后意义

本研究旨在探讨急性髓系白血病(AML)患者治疗过程中,应用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)检测混合谱系白血病(MLL)的相关融合基因MLL-AF9的基因表达水平及其对监测微小残留病(MRD)的价值。应用RQ-PCR精确地定量检测433例初治AML患者中11例MLL-AF9融合基因阳性患者的表达水平,分析该基因表达水平的变化与临床表现的关系。结果显示:患者MLL-AF9融合基因表达水平初诊时为(1.3-55.28)%;5例单纯化疗患者之中有2例在第1个疗程结束后至第2疗程开始前,该融合基因表达水平<0.1%,2例全部获得血液学完全缓解且存活;3例MLL-AF9融合基因≥0.1%,均未获得血液学完全缓解且仅1例存活。6例造血干细胞移植患者中,有4例在移植前1个月内该融合基因表达水平<0.1%,全部患者存活且无复发;2例≥0.1%,均在移植后复发、死亡,且在骨髓细胞形态学复发前1个月内该基因表达水平均≥0.1%。结论:RQ-PCR检测MLL-AF9融合基因可以反映患者MRD的动态变化,与患者的临床预后存在内在相关性,是检测预后的良好指标。此外,RQ-PCR可能有早期检测分子生物学复发的潜力。

成熟免疫表型非L3形态伴MLL-AF9融合基因的儿童急性B淋巴细胞白血病一例报告并文献复习

儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种异质性疾病，依据白血病细胞形态学、免疫学、分子生物学及细胞遗传学的不同可分为不同亚型。这些分型之间既各自独立又互相联系。如根据免疫学分型，儿童B-ALL分为前体B-ALL（pB-ALL）和成熟B—ALL（mB—ALL）。

急性单核白血病细胞系THP-1细胞MLL-AF9融合基因沉默对p27表达的影响

目的研究急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞MLL-AF9融合基因沉默对p27表达及转录调控的影响。方法选择THP-1细胞特有的MLL-AF9融合基因为靶基因，设计并合成MLL-AF9小干扰RNA（siRNA）片段。应用脂质体转染方法，将MLL-AF9 siRNA导入细胞，通过流式细胞术检测siRNA转染效率，用RT-PCR法比较转染前后MLL-AF9 mRNA表达水平的变化，Western blot检测MLL-AF9蛋白水平沉默效果，比较细胞周期抑制蛋白p27表达变化，利用染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，CHIP）技术研究MLL-AF9融合蛋白是否与p27启动子结合。结果转染MLL-AF9 siRNA后THP-1细胞MLL-AF9 mRNA相对表达水平（0．31±0．07）较对照组（1．25±0．13）明显受抑（P〈0．叭），p27mRNA表达水平（0．84±0．12）较对照组（0．35±0．03）明显上调（P〈0．01），应用ChIP结合PCR扩增的方法分析发现MLL-AF9融合蛋白可与THP-1细胞p27基因启动子区域的DNA片段结合。结论MLL-AF9融合基因沉默后可使p27表达上调，其机制可能为MLL-AF9基因沉默解除了MLL-AF9融合蛋白与p27启动子的结合，从而恢复p27基因的表达。

OS-9基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备

OS 9基因广泛表达于人体多种组织 ,该基因的表达产物可能与肿瘤的发生相关 .为获得可溶性表达的OS 9蛋白 ,制备多克隆抗体 ,深入了解OS 9基因的功能 ,将OS 9基因片段克隆入组氨酸标签融合的表达载体pET2 8a中 ,IPTG诱导 ,利用金属螯合亲和层析 (MCAC)进行纯化 ,薄层扫描及Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量 .免疫家兔制备多克隆抗体 ,利用间接ELISA法检测抗体效价 ,Western印迹检测抗体特异性 .经表达形式分析证明 ,融合蛋白大部分可溶 .薄层扫描分析纯度可达 90 %以上 ,Bradford法检测蛋白浓度约 0 1mg ml.抗血清效价可达 1∶32 0 0以上 ,Western印迹检测证明抗体特异性良好 .经诱导表达及纯化制备出可溶的纯度较高的OS 9蛋白产物 。

miR-142-3p靶向调控mll-af4融合基因的实验研究

本研究探讨mll-af4融合基因的表观遗传学调控机制,以筛选靶向调控mll-af4融合基因的microRNA。利用Targetscan在线分析软件预测特异性靶向mllaf4基因3′端非翻译区域(3′-untranslated region,3′UTR)的microRNA,采用PCR方法从1例健康供者DNA中扩增mll-af4基因3′UTR序列,插入经EcoRI和PstI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-M,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶重组质粒及microRNA表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。miR-142-3p mimics以脂质体Hiperfect转染至RS4;11细胞,选用实时定量PCR及Western blot检测mll-af4 mRNA及蛋白的表达。结果表明,成功构建了含有1935bp、2104bp和1371bp的mll-af4基因3′UTR序列的荧光素酶报告重组质粒pGL3-AF4-3′UTR,并通过酶切及基因测序方法鉴定得到证实。荧光素酶报告实验提示,miR-142组荧光素酶活性明显低于对照组。RS4;11细胞中过表达miR-142-3p可以明显下调MLL-AF4融合蛋白及mRNA表达。结论:miR-142-3p通过靶向结合mll-af4基因3′UTR的结合位点特异调控mll-af4基因表达。

伴有6;9染色体易位急性髓系白血病患者DEK-CAN融合基因表达分析

本研究旨在探讨急性髓系白血病(AML)患者6;9染色体易位与DEK-CAN融合基因表达之间的关系及临床意义。患者骨髓细胞短期培养后按常规方法制备染色体,采用R显带技术进行染色体核型分析。用逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nest-PCR)对4例AML患者的骨髓或外周血单个核细胞DEK-CAN融合基因表达进行了分析,并对其中3例行异体骨髓移植(allo-BMT)患者进行动态随访。结果表明:4例急性髓系白血病患者为t(6;9)(p23;q34)易位;4例初诊、再发及完全缓解期患者均不同程度检出DEK-CAN融合基因,占100%;其中初诊、再发期表达明显增强,完全缓解期减弱;3例患者allo-BMT后1-24个月均表达DEK-CANmRNA。临床资料显示4例AML患者中2例于CR后1-24个月复发(其中1例接受异体骨髓移植)、死亡,其余2例完全缓解,在治疗中先后接受异体骨髓移植,现仍然生存。结论:DEK-CAN基因是AML发病的分子基础,检测DEK-CAN融合基因对于AML的诊断、疗效观察及预后判断有重要意义。

细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,用于开发包虫病新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增细粒棘球蚴Eg95和Eg.ferritin基因,采用基因拼接法将Eg95和Eg.ferritin融合,将该融合基因Eg95-Eg.ferritin插入到p Fast Bac DUAL载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf-9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western blot鉴定。结果成功克隆了Eg95和Eg.ferritin基因,通过柔性氨基酸linker成功获得了融合基因Eg95-Eg.ferritin,经PCR和酶切鉴定成功构建了重组质粒p Fast Bac DUAL-Eg95-Eg.ferritin,Western blot结果证实表达蛋白能够被包虫病人标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功表达了细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,与包虫病人标准阳性血清具有良好的反应性。

伴有t(6;9)(p23;q34)/DEK-NUP214融合基因阳性的急性髓系白血病患者的特征分析

目的探讨伴有t(6;9)(p23;q34)/DEK-NUP214融合基因阳性的急性髓系白血病(AML)患者的特征。方法应用流式细胞术对8例初诊AML患者进行免疫分型;8例初诊AML患者的骨髓细胞培养24 h后按常规制备染色体,利用G显带技术进行染色体核型分析;采用实时荧光定量PCR的方法扩增DEK-NUP214融合基因。结果8例患者均异常表达AML抗原谱(主要包括HLA-DR、cMPO、CD33、CD13、CD34、CD11b、CD117);8例AML患者均形成DEK-NUP214融合基因,6例伴t(6;9)(p23;q34)易位,4例进行基因突变检测患者中,2例检出FLT3-ITD突变阳性;在中国人民解放军空军军医大学第一附属医院/西京医院住院治疗的5例患者中,1例未化疗即死亡,2例患者第1疗程用IDA标准剂量化疗,1例无效死亡,1例死于感染;2例行地西他滨联合CAG方案化疗,1例缓解后行异基因造血干细胞移植术,术后1.5年死于肺部感染,1例缓解后很快复发死亡。结论伴有t(6;9)(p23;q34)/DEK-NUP214融合基因阳性的AML是一类独特的、预后极差的急性白血病,检测DEK-NUP214融合基因有助于这类疾病的诊断、危险度分层、疗效观察和预后判断。

MLL-AF6融合基因阳性急性髓系白血病的临床特征及预后

目的:探讨MLL-AF6融合基因阳性的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者的临床特征和预后。方法:回顾分析11例初治MLL-AF6阳性AML患者的临床和实验室资料,复习文献,总结该类疾病的临床特征及预后。结果:11例患者中男6例,女5例,中位年龄36岁,急性白血病的分型诊断标准FAB分型(French-American-British classification systems)M56例,M45例。起病症状为牙龈肿痛6例,发热5例,初诊时中位白细胞计数55.5×10^(9)/L,免疫分型可见髓系细胞、单核细胞系统及干细胞系列抗原表达。MLL-AF6融合基因水平(实时定量PCR法)为14.2%~214.5%,6/11例(54.5%)合并EVI1基因高表达。4例患者二代测序检测出合并KRAS、TET2、ASXL1、TP53、DNMT3A及FLT3-ITD基因突变。染色体G显带检查,2例为t(6;11)(q27,q23)伴复杂核型异常,4/9例(44.4%)伴有+8异常,2例为正常核型。给予患者常规诱导化疗,达到完全缓解者8/11例(72.7%),3例患者原发耐药。8例完全缓解的患者中,2例达到微小残留病(minimal residual disease,MRD)阴性,中位完全缓解的持续时间为4.5个月。2例MRD阳性及3例难治复发患者接受了异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT),后均死于白血病进展。随访至2019年12月1日,2例存活,9例死亡,中位生存时间9个月。结论:MLL-AF6融合基因阳性AML多为年轻患者,FAB分型以M4、M5居多,常以发热起病,白细胞增高,可伴器官浸润,合并EVI1基因高表达多见。本病常规化疗的缓解率不低,但达到分子学缓解困难,极易出现早期复发,持续分子学阴性状态下尽早行allo-HSCT可能获得长期完全缓解。

NUP98-HOXA9融合基因阳性儿童急性髓细胞白血病1例报告

病历资料 患儿男，8岁，2014年4月9日因乏力1个月，发热伴咳嗽半个月，而色苍黄10d入院。患儿精神反应差，面色苍黄，睑结膜、口唇苍白，全身皮肤散在出血点，浅表淋巴结无肿大。咽充血，呼吸平稳，双肺呼吸音清，末闻及干湿性哕音。心率80次／分，律齐。腹平软，肝脾肋下未及。

NUP98-HOXA9融合基因与白血病

血液系统恶性肿瘤常伴有非随机的特征性染色体易位发生,如慢性髓系白血病中的t(9;22) (q34;q11)等。近年来,一些实验室在白血病患者中相继发现并克隆了因t(7;11)(p15;p15)导致的NUP98 HOXA9融合基因。功能研究显示,NUP98-HOXA9具有异常的转录活性,能使细胞恶性转化,干扰细胞的正常分化过程。小鼠模型的结果,部分解释了NUP98-HOXA9在急性髓系白血病及慢性髓系白血病急变过程中的作用,其分子机制的阐明有待深入研究。

表达禽流感H5N1血凝素抗原(HA)和H9N2血凝素抗原(HA)融合基因重组腺病毒二价苗的构建

为了构建禽流感病毒H5N1亚型禽流感病毒HA和H9N2亚型禽流感HA融合基因表达的重组腺病毒。根据流行病学调查并参考文献研究结果,合成了优势流行H5N1和H9N2的保护性抗原HA基因的融合基因片段,并将该融合基因片段克隆到在pUC57载体,命名为pUC-57H5H9HA。该融合基因片段经特异酶切后与腺病毒穿梭质粒pDC315连接,获得携带目的融合基因腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA;将该重组穿梭质粒与AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒(pBHGlox(delta)E1,3Cre)经Cre/loxP酶切重组,构建成重组腺病毒(rAd-H5H9HA);Ad-H5H9HA感染293细胞后,扩增病毒基因,纯化病毒及检测病毒滴度。PCR鉴定及基因测序分析,H5N1HAH9N2HA(H5H9HA)融合基因表达的重组腺病毒载体构建成功;经过重组腺病毒r Ad-H5H9HA免疫SPF鸡后的抗体检测,证实了重组腺病毒r Ad-H5H9HA诱导了H5N1和H9N2的特异抗体,而且抗体水平达到了国家免疫标准。本研究成功构建的重组腺病毒rAd-H5H9HA,可以作为预防H5N1和H9N2两个亚型病毒的二价疫苗使用,为将来禽流感的预防控制提供了一种新的可能。

N9N2亚型禽流感病毒ns1基因的融合表达

华南农业大学动物科学学院陈丽、谢青梅等七位研究生和教授对H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的研究结果表明：禽流感病毒（AIV）非结构蛋白NS1在病毒粒子中不存在，故可通过检测NS1抗体来鉴别禽流感受病毒感染鸡群和免疫鸡群,将NS1基因和T4等菌体SOC基因在大肠埃希氏菌中融合表达，其融合蛋白可以作为鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群的检测抗原。采用RT-PCR方法扩增禽流感病毒H9N2的NS1基因（654bp）；

逆转录病毒介导的小鼠MLL-AF9白血病模型的建立

本研究旨在建立逆转录病毒介导的小鼠MLL-AF9白血病模型,为深入研究MLL白血病的发病机制和治疗策略奠定基础。采用免疫磁珠分选法分离CD45.2小鼠骨髓c-Kit+细胞,用携带MSCV-MLL-AF9载体的逆转录病毒感染c-Kit+细胞,体外培养后经尾静脉注射入致死剂量照射的CD45.1受体小鼠体内,用PCR、流式细胞术、形态学等方法鉴定成模情况。结果表明,MLL-AF9逆转录病毒可以成功感染c-Kit+细胞,感染后细胞克隆形成能力强,细胞呈髓系原始幼稚形态,高表达Gr-1、Mac-1等髓系标志,MLL相关基因Hoxa9、Meis1表达升高。移植MLLAF9细胞后的受体小鼠,于6至12周出现白血病样体征,外周血涂片、骨髓细胞甩片、肝脏和脾脏组织切片均显示有大量白血病细胞浸润,骨髓和脾脏细胞中CD45.2群细胞高表达Gr-1、Mac-1等髓系标志,小鼠在12周内死亡。结论:成功建立逆转录病毒介导的小鼠MLL-AF9白血病模型,可应用于后续实验研究。

miRNA-495靶向STYX调节MLL-AF9的急性髓系白血病细胞的增殖和凋亡

目的探究miRNA-495对混合谱系白血病基因(mixed lineage leukemia,MLL)基因重排的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)增殖和凋亡的影响。方法收集2017年8月至2019年5月于宁夏医科大学总医院血液科就医确诊为AML的10例MLL-AF9白血病患者[男性6例,女性4例,年龄(39.37±2.71)岁];10例急性髓系白血病患者[男性5例,女性5例,年龄(41.12±1.92)岁];同时间段于外科门诊就医患者10例[男性6例,女性4例,年龄(42.31±3.21)岁]。根据是否转染miRNA-495 mimic分组为miRNA-495组和Control组,通过RT-qPCR检测各组miRNA-495的表达;CCK-8检测各组转染THP-1细胞的增殖情况;RT-qPCR和Western blot检测各组转染THP-1细胞增殖相关因子(Ki-67和PCNA)和细胞凋亡相关因子(Bcl-2、Bax和Caspase-3)的表达;Target Scan预测miRNA-495的靶基因并用双荧光素酶报告实验验证;RT-qPCR和Western blot检测miRNA-495组(转染miRNA-495)、Control组、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸相互作用蛋白(Serine/threonine/tyrosine interacting protein,STYX)组(转染STYX)和miRNA-495+STYX组(转染miRNA-495和STYX)中STYX的表达。结果 miRNA-495在MLL-AF9的AML患者中表达下调[MLL-AF9患者相对表达量(0.25±0.08),95%CI:-0.86~-0.65,P<0.01,P<0.001];miRNA-495可以抑制THP-1细胞增殖(P <0.05,P <0.01,P <0.001);miRNA-495可以诱导THP-1细胞的凋亡(P<0.05,P<0.001);miRNA-495靶向结合STYX(P<0.01,P<0.001);STYX过表达可以逆转miRNA-495对THP-1细胞增殖和凋亡的作用(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论 miRNA-495通过靶向STYX调控MLL基因重排的急性髓系白血病细胞的增殖和凋亡。

狂犬病病毒SRV_9株磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因重组质粒的构建

【目的】重组狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白的P基因和基质蛋白的M基因,为构建狂犬病毒(SRV9)全长c DNA提供技术支撑。【方法】设计重组PCR引物,分别扩增SRV9的P基因和M基因,构建重组质粒p MD18-PM,并对重组质粒进行酶切、测序鉴定。【结果】PCR扩增的SRV9的P基因和M基因大小分别为893 bp和608 bp,与Gen Bank已发表的狂犬病病毒SRV9(登录号:AF499686)序列比较,同源性分别为99.66%和99.67%。融合基因PM片段大小为1 501 bp,与预期大小相同,且融合完全。【结论】应用重组PCR成功融合狂犬病病毒SRV9磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因,为后续构建病毒全长c DNA及感染性克隆奠定基础。

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A/Duck/Shantou/2088/01(H9N2)亚型禽流感病毒ns1基因,构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA,将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中,构建重组质粒pGEX-4T-3/ns1,转化BL21(DE3)宿主菌;采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1基因;并用IPTG诱导工程菌,SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明,ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中,测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白在BL21(DE3)工程菌中以可溶形式表达,重组融合蛋白GST-NS1的表达量占菌体总蛋白的20%左右。经West-ern blotting分析证实,重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因,构建了融合表达载体,并进行了融合蛋白的诱导表达,为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。

慢性粒细胞白血病中相关融合基因的研究进展

研究证实,慢性粒细胞白血病(CML)中BCR/ABL融合基因具有极高的酪氨酸激酶活性,通过改变作为BCR/ABL催化底物的一些关键调节蛋白的磷酸化状况,激活多种信号转导途径,可致疾病的发生。除此之外,NUP98-HOXA9及RUNX1-EVI1等融合基因在CML病程中亦发挥重要作用,但具体机制尚未明了。本文就CML中相关融合基因的研究进展作一综述。

伴MEF2D-BCL9融合基因的急性B淋巴细胞白血病1例

目的探讨伴MEF2D-BCL9融合基因在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)预后评估的作用,以提高危险度分层的准确性,并为白血病的个体化诊疗提供临床经验。方法回顾性分析广东医科大学附属医院既往收治的1例伴MEF2D-BCL9融合基因的B-ALL患儿的临床特征和诊治经过,并进行相关文献复习。结果7岁男童,2020年12月收入广东医科大学附属医院治疗。通过转录组测序技术(RNA-seq)检测出MEF2D-BCL9融合基因,骨髓流式提示幼稚/原始B淋巴细胞占有核细胞总数的79.3%,符合前B淋巴细胞白血病(pre-B-lymphoblastic leukemia,Pre-B-ALL)。经华南地区儿童急性淋巴细胞白血病治疗协作组2016方案化疗,但在缓解后2个月内复发,家属由于经济原因未同意进行造血干细胞移植,最终因严重感染死亡。结论伴MEF2D-BCL9融合阳性的B-ALL患儿通常表现出对化疗耐药、复发时间较短以及复发后的无病生存率较低等不良预后特征,此外常伴有高白细胞计数、发病年龄大和HDAC9过表达等高危特征,可能受益于靶向治疗和造血干细胞移植。

禽致病性大肠杆菌IMT5155株毒力相关基因片段E9的表达及生物学特性分析

根据禽致病性大肠杆菌IMT5155毒力相关基因E9的序列,设计并合成了1对特异性引物,以IMT5155菌株的基因组DNA为模板扩增了E9基因所在ORF的部分序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a(+)载体中,构建了原核表达质粒pET-28a-E9,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(32.2 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有免疫反应性。对重组蛋白进行纯化后免疫动物进行抗体效价测定,进一步分析重组蛋白的相关生物学功能,分别进行了细胞毒性试验、动物试验、细胞黏附与黏附影响试验。结果表明,该蛋白没有细胞毒性,对小鼠亦无毒性,有一定的黏附作用。