中国南瓜MLO基因的鉴定与表达分析

MLO蛋白是植物特有的一类蛋白家族,其部分成员是植物感染白粉病的必要因子,其功能的缺失突变可诱导植物对白粉病病菌产生广谱且持久的抗性。为了揭示中国南瓜MLO基因的结构特点、系统发育关系及其功能特点,以已知的中国南瓜基因组信息为基础,采用生物信息学方法对中国南瓜的MLO基因进行鉴定分析。结果表明,中国南瓜基因组中含有20个MLO(CmoMLO)基因,分布在14条染色体上。中国南瓜CmoMLO基因大小从2 965 bp到9 967 bp不等,这些基因所编码的蛋白质氨基酸序列长度从324到1 264个不等。对应的等电点为6.26~9.63,分子权重为36 403.18~140 267.57 ku,外显子个数为6~22个。20个CmoMLO基因编码的蛋白质氨基酸序列含有2~8个不等的跨膜区。系统进化分析显示,20个中国南瓜CmoMLO蛋白被分为6个分枝,其中CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19这5个被划分到第Ⅴ分支。通过抗感材料接种后不同时期取样,分析位于第Ⅴ分枝的MLO基因的表达量差异,结果表明,CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19可能是参与白粉病病菌侵染中国南瓜的重要相关基因,且接种后24 h是MLO基因参与白粉病侵染的关键时期。本研究结果可为后期中国南瓜抗白粉病材料的创制与挖掘提供参考。

不同物种Mlo基因生物信息学分析

应用比较基因组学和生物信息学方法,比较了从藻类到高等植物Mlo基因的CDS序列,并对该基因的遗传多样性、氨基酸功能结构及分子系统发育进行分析。结果表明,85条基因序列共检测到57个多态位点,生成70个单倍型。物种间及物种内Mlo基因存在丰富的遗传多态性;氨基酸结构域分析发现,20个物种含有一段特定的Mlo结构域,其中低等植物的跨膜螺旋区域(1～5)明显比高等植物的跨膜螺旋区域(6～8)少;分子系统进化树结果显示,不同物种的聚类情况与植物学分类系统基本一致。本研究为进一步探索Mlo基因的生物学功能和确定该基因作为分子标记提供了基础依据。

烟草Mlo基因的克隆及其序列特性分析

Mlo基因家族是一类植物抗病的负调控因子,该基因的突变能产生广谱的抗病性。以GenBank公布的水稻Mlo基因序列(登录号:AK099399.1)为信息探针对烟草的EST数据库进行同源搜索,并将获得的同源性高的EST序列进行拼接,最后得到了烟草Mlo基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了与预期大小一致的Mlo基因cDNA片段951 bp,该基因可编码304个氨基酸。采用生物信息学方法预测分析了该基因编码蛋白的一、二级结构,并对其功能进行了预测。结果表明,该烟草Mlo基因编码蛋白包含有一个保守的Tmemb_40结构域,可能是一种类似于植物G蛋白偶联受体的膜结合转运蛋白。

瓜叶菊Mlo基因的克隆、分析及VIGS载体构建

试验以瓜叶菊(Pericallis hybrida B.Nord.)为试验材料,采用RT-PCR和RACE方法获得白粉菌调控相关Mlo基因的cDNA全长序列,通过VIGS技术构建载体,进行基因沉默并转入到农杆菌GV3101中。序列分析表明,该基因cDNA全长包含1个1 296 bp的开放阅读框,编码431个氨基酸。荧光定量结果表明,Mlo基因在瓜叶菊的根、茎、叶中都有表达,叶片中表达量最高,根中表达量最低。根据PCR结果和双酶切鉴定结果表明载体构建成功。通过PCR结果显示载体已成功转入农杆菌GV3101中。该研究为下一步分析基因沉默后瓜叶菊中Mlo基因变化提供依据。

辣椒MLO基因家族鉴定及表达分析

MLO基因是植物中特有的一类抗病负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。为研究MLO基因家族在辣椒中表达模式及功能分析,运用生物信息学方法,在辣椒基因组中鉴定出17条候选MLO基因序列。其分子量范围187k^593kDa,等电点范围6.65~9.7。结构分析发现,辣椒MLO基因具有较多内含子,并且差异性较大。发现辣椒MLO基因有20个基序,分布较均匀且排列顺序一致。进化分析发现,单子叶和双子叶MLO基因在进化上有差异,与辣椒关系最近的是茄科的番茄。表达分析显示,辣椒MLO基因具有表达特异性。Capana01g003047在脱落酸诱导下,显著上调表达。Capana05g002411对脱落酸和疫病具有抵抗作用,在其诱导下上调表达。Capana08g000223同样在疫病胁迫下上调表达。

一个烟草Mlo基因的电子克隆及其序列特性分析

电子克隆并探讨了一个烟草Mlo基因的结构和功能.以GenBank公布的水稻Mlo基因序列为信息探针对烟草的EST数据库进行同源搜索,并将获得的同源性高的EST序列进行序列拼接,最后得到了一个烟草Mlo基因的cDNA序列.采用生物信息学方法分析该基因编码蛋白的一级、二级结构,并对其功能进行预测.结果表明,此烟草Mlo基因编码一个由288个氨基酸组成的蛋白,相对分子质量为33kD,有7个跨膜区域,蛋白二级结构以α螺旋为主,有1个DUF1084超家族的保守结构域.蛋白功能分析表明,该烟草Mlo基因编码蛋白具有跨膜介导信号传递的功能,可能是一种类似于G蛋白偶联受体的膜结合转运蛋白.

瓜叶菊‘大花’Mlo基因RNAi载体的构建及其遗传转化研究

为进一步研究瓜叶菊Mlo基因的功能以及为将来获得具有广谱与持久的白粉菌抗性瓜叶菊种质资源奠定基础,以瓜叶菊(Pericallis hybrida B.Nord)‘大花’为试验材料,克隆瓜叶菊‘大花’Mlo基因保守片段,构建了瓜叶菊‘大花’RNAi载体;同时构建了瓜叶菊‘大花’高频再生体系;并利用根癌农杆菌介导法转化瓜叶菊‘大花’进而建立了遗传转化体系。经酶切鉴定,成功构建了Mlo基因的RNAi载体质粒pTCK303-mlo-RNAi,构建了瓜叶菊‘大花’高频再生体系,最终确定瓜叶菊‘大花’最佳愈伤诱导培养基为:MS+6-BA 2.4mg/L+NAA 1.0mg/L+KT 0.3mg/L+2,4-D 1.0mg/L;瓜叶菊‘大花’愈伤组织的分化培养最适培养基为:MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.1mg/L;瓜叶菊‘大花’生根培养的最佳培养基为1/2MS+NAA 0.5mg·L-1,并且初步探索了瓜叶菊‘大花’Mlo基因转化体系。

植物抗白粉病MLO基因研究进展

目前,人们已从多种植物中分离并克隆了MLO(mildew resistance locus O)基因,构成了MLO基因家族,该基因家族为植物所特有。MLO基因存在于植物的各个组织中,功能各异,研究较多的是MLO基因能够促进白粉菌(Erysiphe)侵入植物细胞中,为植物感染白粉病(powdery mildew)所需,MLO基因可通过缺失或突变获得等位基因mlo,导致MLO蛋白功能丧失,从而获得具有对白粉菌持久而广谱抗性的mlo突变体植株。传统的抗病基因(resistace gene,简称R)专化性较强,维持抗性的时间短,MLO基因弥补了R基因的这种抗性上的缺陷,因此该基因的研究对培育抗病品种具有深远的意义。本文主要对MLO基因的发现、基因的生物信息学研究、基因的抗病机制进行了讨论。

烟草反义Mlo基因表达载体的构建

获得烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo,为进行烟草遗传转化,获得该基因表达的缺陷型植株打下基础.从烟草叶片中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到Mlo基因的c DNA,以此为模板设计反义引物,通过PCR扩增出反义Mlo基因,将此反义Mlo基因与T载体连接,测序正确后再将此反义片段与植物表达载体pBI 121连接,构建烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo.经Kan选择筛选出反义重组菌落,碱裂解法小量提取质粒后,用Xba I和Bam HI双酶切后再进行电泳鉴定.结果表明,目的基因已与植物表达载体pBI 121连接成功.成功构建了烟草反义Mlo基因表达载体pBI 121-Mlo.

VIGS技术初步鉴定RgMLO6和RlMLO7基因对白粉病的负调控功能

为了探讨蔷薇科植物MLO基因在抗白粉病中的作用,研究应用病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)抑制了大花香水月季RgMLO6基因和长尖叶蔷薇RlMLO7基因的表达,随后接种白粉菌对这2个基因进行抗性鉴定.研究发现在VIGS载体转化植株叶片20 d后,RgMLO6和RlMLO7基因的相对表达量显著下降了80%~90%,沉默效果明显.分别对2个基因沉默后的嫩叶进行白粉病抗性鉴定,大花香水月季和长尖叶蔷薇的抗性水平较对照组均提高.显微镜观察白粉菌接种2个基因沉默后植株叶片中菌丝体的生长情况,整体表现出沉默植株叶表皮细胞上的白粉菌生长较对照组生长缓慢.结果表明RgMLO6与RlMLO7基因对蔷薇科植物的白粉病有负向调控作用.

大麦抗白粉病基因Mlo的研究进展

野生型Mlo基因是大麦抗白粉病的负调控因子,该基因突变,赋予大麦对白粉菌的广谱抗性。综述了Mlo基因结构、功能及Mlo突变的等位基因(mlo)的抗性特点;讨论了mlo基因可能的抗病机制。为mlo抗性在麦类白粉病抗病育种中的应用提供了理论基础。

一个玉米Mlo基因的电子克隆与生物信息学分析

Mlo基因家族在植物抗病方面有极大的优势,但有些Mlo基因的功能还未知。经序列拼接电子克隆得到1个玉米的Mlo基因,采用生物信息学方法预测分析了编码蛋白的一、二、三级结构,并对其功能进行了预测。结果表明:玉米Mlo基因编码的蛋白有一个保守的DUF1084结构域,此结构域功能在植物中尚未知。生物信息学分析表明,此蛋白很可能是一种类似于G蛋白偶联受体的膜结合转运蛋白而参与到信号传递过程中。

小麦Mlo反义基因的转化及转基因植株的白粉病抗性分析

采用基因枪法将小麦反义Mlo基因导入扬麦158和济麦20的幼胚愈伤组织中,在含除草剂的分化培养基上经两轮筛选,获得抗性再生植株。PCR检测、PCR-Southern杂交、基因组DNA斑点杂交和除草剂BASTA抗性分析结果证实已获得转基因扬麦158和济麦20阳性植株,荧光定量表达分析亦证明Mlo基因发生沉默。对T0和T1代转基因植株的白粉病抗性鉴定表明,有6个转基因株系高抗白粉病。对T1代转基因小麦接种白粉菌后孢子发育的显微观察结果显示,Mlo反义基因的导入明显加快了乳突的形成和维持时间,有效抑制了吸器的发育,因而使转Mlo反义基因材料表现抗病性。

小麦TaMlo8基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小麦Mlo基因家族新成员,分析其编码蛋白的结构、进化地位以及其在小麦根、茎、叶组织和生物胁迫下的表达模式。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从小麦品种"水源11"中分离出1个Mlo的cD-NA序列基因,对其进行克隆和序列分析;利用InterProScan、TMpred、SignalP等在线分析工具,预测TaMlo蛋白的保守结构域、跨膜结构、信号肽、细胞定位等特征;采用DNASTAR软件分别进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析,并利用qRT-PCR技术对其表达谱进行分析。【结果】以玉米ZmMlo8基因为种子序列,克隆了小麦新基因TaMlo8(暂命名)cDNA序列,该序列长1 897bp,ORF为1 497bp,编码499个氨基酸;InterProScan和SignalP预测结果显示,其为Mlo家族成员,含信号肽和7个跨膜区;BLASTX结果显示,TaMlo8与玉米ZmMlo8蛋白的相似性达78%;系统进化树显示,TaMlo8与玉米ZmMlo8处于同一分支下,而与小麦其他Mlo家族成员处于不同的分支上,进一步说明TaMlo8为小麦Mlo家族的新成员;表达谱分析表明,TaMlo8是组成型低表达,在小麦根、茎、叶组织中的表达量基本一致,在小麦与条锈菌互作的非亲和体系中诱导表达,在小麦与白粉菌的感病反应中诱导表达。【结论】克隆到1个小麦Mlo基因新成员TaMlo8,其在小麦与条锈菌的抗性反应和小麦与白粉菌的感病反应中起一定作用,说明TaMlo8基因对条锈菌和白粉菌的抗病路径可能不同,为进一步研究其在小麦生物胁迫反应中的潜在功能奠定了基础。

不同植物Mlo基因全基因组鉴定及系统进化分析

Mlo作为一类广谱抗病因子,参与植物多种生物与非生物胁迫反应。为研究不同物种Mlo基因的基本特征及进化关系,选取已测序的29种代表性植物,利用生物信息学方法对其进行鉴定及系统进化分析。结果显示:共有198个植物Mlo基因被鉴定,各基因具有11~14个外显子,编码400~600个氨基酸,翻译碱性疏水性稳定蛋白,部分Mlo含信号肽和钙调素结合区,绝大多数Mlo定位于细胞膜,含5~7个跨膜螺旋结构。基序分析发现,10个保守基序长21~50个氨基酸。染色体定位发现174个Mlo不均衡地散布于不同染色体或scaffold上,且主要位于两端,形成19个(24.1%)基因簇、5对(5.7%)串联重复和61对(36.2%)片段重复。系统聚类可将164个Mlo分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个区组,被子植物Mlo主要聚在ⅠA组,江南卷柏Mlo聚在ⅠA和ⅢB组,小立碗藓Mlo聚在ⅠB和ⅢA组,几乎所有藻类Mlo聚在Ⅱ组。同源性分析发现52.4%的Mlo以同源基因形式存在,包括25对直系同源基因和28对旁系同源基因,其Ka/Ks值为0.01~0.78,说明进化中主要受到纯化选择。研究表明植物Mlo基因家族较保守,具有成簇存在的特点,在进化过程中经重复扩张,形成了大量同源基因,同时也发生了不同程度的丢失,结果为相关基因分离及植物抗病育种应用提供了理论依据。

Mlo基因在葡萄抗白腐病中作用的研究

Mlo转录因子是植物抗病反应中一类重要的负调控因子。试验通过对葡萄(Vitis vinifera)VvMlo基因家族成员的基本特征、基因结构、染色体位置、蛋白结构进行分析,结合其他作物已报道的抗病相关Mlo基因构建系统进化树,推断与葡萄抗病机制相关的Mlo基因。另以抗病刺葡萄(V.davidii)品种‘刺葡萄0943’和感病葡萄(V.vinifera)品种‘美人指’为材料,分析不同材料Mlo基因的表达量,获得对白腐菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)有响应的Mlo基因。结果显示:抗白粉病的拟南芥Mlo基因(AtMlo2、AtMlo6、AtMlo12)、番茄(Solanum lycopersicum)SlMlo1基因以及葡萄Mlo基因(VvMlo3、VvMlo6、VvMlo9.1、VvMlo13.1、VvMlo13.2、VvMlo17)聚在第IV组。第IV组中的‘刺葡萄0943’和‘美人指’Mlo基因在接种白腐菌后有不同的响应。此外,在白腐菌侵染过程中,第VI组中VvMlo15的表达量明显高于VdMlo15,且在整个接菌过程中VvMlo15对白腐菌侵染有响应,VdMlo15对白腐菌几乎无响应。VvMlo15的基因结构、蛋白结构、分子质量、等电点、跨膜结构等特点也与第IV组中的VvMlo基因特点更相似。综合推测,VdMlo15在葡萄抗白腐病方面可能具有重要作用。

全基因组水平上芸薹属Mlo抗病基因的比较分析

为揭示植物广谱抗病机制,创造优良的抗白粉病新抗源,了解芸薹属全基因组水平的MLO基因家族,利用保守结构域的隐马模型,分析拟南芥、白菜、甘蓝和油菜中123个MLO类型抗病基因。进化分析发现,拟南芥和芸薹属物种Mlo抗病基因的进化树非常清晰地分成3个亚组。关系分析显示,拟南芥Mlo3和Mlo9基因在芸薹属物种中并没有找到对应的同源基因。通过跨膜结构域分析发现,71个MLO类型抗病基因有超过7个跨膜结构域,且包含超过12个外显子结构。这些基因符合MLO类型抗病基因的典型特征,可能是四个物种中主要的功能基因。通过对71个Mlo抗病基因的保守结构域分析发现,四个物种中均含有1个共有的保守氨基酸序列(长度462aa),这段保守的氨基酸序列可能是Mlo基因的主要功能序列。除了Mlo3和Mlo9,其余Mlo基因都发生了不同程度的扩张。

糜子抗白粉病基因(Mlo)编码蛋白的序列特征及表达分析

[目的]探究糜子抗白粉病基因(Mlo)编码蛋白的序列特征及mRNA表达特性,以期为该基因的克隆提供基础数据。[方法]利用一系列生物信息学软件分析糜子Mlo蛋白理化特性,并采用室内接种和qRT-PCR技术检测在接种白粉菌后,糜子叶片Mlo基因mRNA表达量的变化。[结果]糜子中Mlo蛋白的化学式为C1856H3105N609O756S170,原子总数为6 496个,分子量为51 497.90Da;编码609个氨基酸,含有一个保守结构域(第1～348位氨基酸之间);该蛋白为分泌蛋白,具有信号肽,异亮氨酸为其核输出信号。7种植物Mlo蛋白序列进化树和多重序列比对结果表明糜子与黄瓜的序列一致性为100%,与3种葫芦科植物(西葫芦、苦瓜和南瓜)的一致性超过80%,与陆地棉的一致性为65%,与大豆的一致性为59%。实时定量PCR检测结果表明,在接菌处理后不同时间,糜子Mlo表达水平存在显著差异。随着接种天数增加,Mlo基因相对表达量呈现先增加后降低的趋势。6、9和12d时,mRNA含量与对照组呈极显著差异,9d时表达量最高,为对照的4.33倍,15d时mRNA含量与对照组差异不明显。[结论]糜子Mlo基因可以由接种白粉菌诱导表达。

根癌农杆菌介导大麦Mlo反义基因转化小麦

应用含有大麦Mlo反义基因表达载体的根癌农杆菌菌株AglⅠ ,对 3种基因型小麦 (核生 3号、烟优 36 1、扬麦15 8)的愈伤组织进行了转化 .从其中 2种基因型获得 2 3株转基因植株 ,有 2株是白化苗 ,转化频率分别为 1.9%(核生 3号 )和 2 .8% (扬麦 15 8) .PCR及Southern分析表明 ,外源基因已整合进植物基因组 .实验结果表明 ,筛选压力的存在对转基因植株的获得至关重要 ,在无筛选压力下未获得转基因植株 .

木薯Mlo基因家族成员的鉴定及其序列特征分析

Mlo基因家族是植物重要的抗病基因。本文通过系统分析木薯基因组数据库,从中共鉴定出21个Mlo成员,其中20个具有完整序列,1个只有部分序列。对其中20个具有完整序列的基因与其他物种的Mlo基因进行聚类关系分析,结果显示,可将木薯Mlo基因家族分为6类(I^VI),其中4类都包括有来自拟南芥的Mlo基因,第VI类只包括2个木薯Mlo基因,可能是木薯中特有的一类Mlo;6个木薯Mlo与已知的抗病Mlo基因分别聚在第IV和第V类,这6个基因可能是木薯基因组中具有抗病功能的Mlo。对所有的木薯Mlo蛋白进行结构分析发现,除了MeMlo20外,其他蛋白均具有6~8个跨膜结构,其中3个蛋白具有N端信号肽。