骨碎补总黄酮对MLO-Y4细胞增殖、分化、矿化和凋亡影响的探究

目的研究骨碎补总黄酮对MLO-Y4类骨细胞系增殖、分化、矿化以及凋亡的影响。方法体外培养MLO-Y4细胞,并以MC3T3-E1细胞作对照细胞,分别用不同质量浓度(1,10,100 mg/l)的骨碎补总黄酮干预,采用CCK-8法以及ALP试剂盒检测MLO-Y4细胞的增殖和分化情况;用茜素红染色法观察矿化结节的形成;DAPI染色和流式细胞术定性和定量反映依托泊苷诱导的细胞凋亡情况。结果 1,10 mg/l浓度组的骨碎补总黄酮能促进MLO-Y4细胞的增殖,并且能够一定程度上促进细胞ALP的合成分泌,100 mg/l组不具有促进细胞增殖,ALP合成分泌的作用。三个浓度组均无影响MLO-Y4细胞钙结节形成的作用。1,10 mg/l组对依托泊苷诱导的细胞凋亡具有一定的抑制作用,100 mg/l组则相反。结论一定浓度的骨碎补总黄酮对MLO-Y4细胞的增殖,分化有一定的促进作用,并能够抑制其凋亡。

TNF-α诱导MLO-Y4细胞发生RIP3介导的程序性坏死

目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)能否诱导小鼠长骨骨样细胞株MLO-Y4发生程序性坏死及其发生机制。方法:将MLO-Y4细胞分为正常对照(control)组、TNF-α处理组、TNF-α+necrostatin-1(Nec-1)处理组、TNF-α+Z-VAD处理组和TNF-α+受体相互作用蛋白3(RIP3)-siRNA组。用流式细胞术检测各组细胞凋亡或坏死率,透射电镜鉴定细胞形态学变化,用Western blot法测定RIP1、RIP3和cleaved caspase-3的蛋白水平,应用激光共聚焦显微镜观察RIP1和RIP3蛋白的共表达,应用荧光标记法检测各组细胞活性氧(ROS)水平。结果:TNF-α诱导MLO-Y4细胞24 h,凋亡和坏死率明显高于control组(P<0.01)。与TNF-α组相比,Nec-1、Z-VAD和RIP3-siRNA均能降低细胞的凋亡或坏死率(P<0.01)。在TNF-α组可见大量坏死样细胞,在Z-VAD组仍可见到坏死样细胞,而在Nec-1和RIP3-siRNA组未见到坏死样细胞。Western blot实验结果显示Nec-1可有效抑制RIP1蛋白表达,而Z-VAD对RIP1和RIP3蛋白表达无影响,RIP3-siRNA可有效降低RIP3蛋白表达(P<0.01)。与TNF-α组比较,Nec-1可有效降低RIP1-RIP3蛋白共表达阳性细胞百分率(P<0.01),而Z-VAD对其无影响。与control组相比,TNF-α组的ROS水平明显增高(P<0.01);与TNF-α组相比,Nec-1、Z-VAD及RIP3-siRNA均能有效抑制ROS水平(P<0.01)。结论:TNF-α能诱导MLO-Y4细胞发生RIP3介导的程序性坏死;ROS可能是MLO-Y4细胞程序性坏死的执行者。

小鼠骨样细胞MLO-Y4转染方法的研究

为了建立质粒转染小鼠骨样细胞MLO-Y4的方法,分别采用阳离子脂质体法和电转染法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒pEGFP-C1转染小鼠骨样细胞MLO-Y4,正常培养48h后检测并统计转染率和死亡率。结果显示,脂质体法转染,当质粒与脂质体比例为1∶4时,转染效率可达到(36.8±3.7)%,细胞死亡率为(18.4±1.9)%;电转染法转染,脉冲电压240 V,脉冲时间300μs,脉冲次数3次时,转染率最高,可达到(23.8±2.3)%,细胞死亡率为(14.1±1.1)%。而后MTT实验显示脂质体转染法相对于电转染法对MLO-Y4细胞的增殖有一定的抑制作用,但对后续实验研究影响不大。脂质体转染法转染小鼠骨样细胞MLO-Y4优于电转染法。

槲皮素通过抗骨相关细胞衰老作用治疗雌激素缺乏骨质疏松症的初步研究

目的通过体内外实验探究槲皮素对骨相关细胞衰老的影响,验证槲皮素通过抗骨相关细胞衰老作用对绝经后骨质疏松症的治疗作用。方法选取小鼠骨细胞样细胞MLO-Y4及成骨细胞样细胞MC3T3-E1,构建体外压力诱导的成熟前衰老(stress induced premature senescence, SIPS)模型,通过qRT-PCR法和细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色确定细胞衰老样变化,利用CCK-8法确定槲皮素体外工作浓度,验证槲皮素在骨相关细胞SIPS中的作用。建立去势小鼠骨质疏松模型,槲皮素灌胃给药,与经典雌激素疗法相比较,利用micro-CT扫描分析骨参数及骨微结构的变化,并通过qPCR检测小鼠皮质骨内衰老相关基因p21、p53,衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype, SASP)TNF-α、IL-6以及破骨相关基因TRAP、CTSK和成骨相关基因OCN、RUNX2的表达情况。结果体外实验证明槲皮素能有效抑制骨相关细胞SIPS样改变( P <0.05)。体内实验发现,给药12周后,相较对照组小鼠,槲皮素组小鼠股骨骨表面积与骨体积比值(BS/BV)和骨小梁分离度(Tb.Sp)显著降低( P <0.05),骨小梁数量(Tb.N)显著升高( P < 0.05),骨质疏松程度减轻,较雌激素疗法差异无统计学意义,并伴骨内SIPS相关基因p21、p53及SASP水平下调( P <0.05),成骨水平不受明显抑制。结论槲皮素可通过抑制细胞衰老挽救由雌激素缺乏导致的骨丢失;这可能成为绝经后骨质疏松症治疗的新手段。

机械力对骨细胞诱导破骨细胞分化作用的影响

目的评估机械力对骨细胞诱导破骨细胞分化作用的影响。方法对MLO-Y4骨细胞施以12 dyn/cm2流体剪切力,在加力第1、2、4、6、12、24小时,收集加力后的细胞与同源性小鼠骨髓干细胞共存培养,于第9天进行抗酒石酸磷酸酶染色,计数并比较染色阳性的破骨细胞数目。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测不同加力时间点上骨细胞骨保护因子(OPG)和破骨细胞分化因子(RANKL)mRNA表达的时序性变化。结果与未受流体剪切力刺激的骨细胞相比,受力后所有时间点MLO-Y4骨细胞诱导形成的破骨细胞数量均明显降低(P均<0.01)。MLO-Y4骨细胞的OPG mRNA表达在流体剪切力作用12 h内明显升高(P<0.001),RANKL mRNA在流体剪切力作用4 h内明显降低(P<0.05),RANKL/OPG比值在流体剪切力作用12 h内均明显降低(P<0.01);上述变化在加力24 h时与加力前的差异无统计学意义(P>0.05)。结论在12 dyn/cm2流体剪切力负载作用下,MLO-Y4骨细胞表现出抑制骨吸收的骨保护作用。随着机械负载时间延长,这种作用逐渐消失。

肿瘤坏死因子α调控ERK1/2信号通路促进长骨骨样细胞凋亡

背景:肿瘤坏死因子α作为促炎因子可诱导成骨细胞凋亡,增强破骨细胞功能,从而造成炎症性骨破坏,但是其作用机制尚不明确。目的:探讨炎症因子肿瘤坏死因子α对长骨骨样细胞MLO-Y4增殖、凋亡的影响及可能机制。方法:将MLO-Y4细胞分为对照组、肿瘤坏死因子α组、ERK1/2抑制剂组。肿瘤坏死因子α组用含50μg/L肿瘤坏死因子α的α-MEM完全培养基孵育24 h,ERK1/2抑制剂组用含50μmol/L PD98059的α-MEM完全培养基孵育24 h,对照组单纯采用α-MEM完全培养基孵育24 h,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒检测细胞氧化应激水平,用Western blot法测定PCNA、cleaved caspase-3、p-ERK1/2、ERK1/2的蛋白水平。结果与结论:①与对照组相比,50μg/L肿瘤坏死因子α处理24 h后,细胞增殖能力下降,凋亡率上升;细胞脂质过氧化物丙二醛水平显著增加,而抗氧化物酶超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低;②与对照组相比,肿瘤坏死因子α组细胞增殖相关蛋白PCNA的表达显著降低,细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达显著升高,p-ERK1/2的表达降低,而总蛋白ERK1/2的表达基本保持不变。ERK1/2抑制剂组上述指标与肿瘤坏死因子α组无显著差异;③结果表明,50μg/L肿瘤坏死因子α可使长骨骨样细胞MLO-Y4增殖能力下降,细胞凋亡增多,其作用机制可能与抑制MAPK-ERK1/2信号通路的活化有关。

牛膝-杜仲药对治疗糖皮质激素性骨质疏松症的网络药理学分析

目的运用网络药理学方法及体外实验探讨牛膝-杜仲药对治疗糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)的作用机制。方法利用TCMSP数据库筛选牛膝-杜仲药对的活性成分并预测其作用靶点;利用DrugBank、GeneCards、OMIM、PharmGkb数据库筛选GIOP疾病相关靶点,并与牛膝-杜仲活性成分作用靶点映射取交集,交集基因即为牛膝-杜仲药对治疗GIOP的潜在作用靶点。采用STRING数据库构建潜在作用靶点的蛋白互作(PPI)网络;利用Cytoscape 3.8.2软件构建“活性成分-潜在作用靶点”网络;通过R 4.1.1软件对潜在作用靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。以牛膝-杜仲(10μg·mL-1)对地塞米松(10-5mol·L^(-1))诱导损伤的MLO-Y4骨细胞进行干预,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果从牛膝、杜仲中分别筛选出20、28个活性成分,预测得到976个作用靶点(牛膝、杜仲共同作用靶点205个),筛选出2006个GIOP疾病相关靶点,最终确定133个牛膝-杜仲药对治疗GIOP的潜在作用靶点。筛选出槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素、β-胡萝卜素、β-谷甾醇、豆甾醇等关键活性成分;得到JUN、FOS、ESR1、MYC、CDKN1A、AKT1、CCND1、CTNNB1、HIF1A、MAPK14、RELA等核心靶点;KEGG通路富集分析得到166条信号通路,筛选得到与GIOP密切相关的细胞增殖、凋亡相关通路及骨代谢相关通路。体外实验结果显示,与模型组比较,牛膝+杜仲组的细胞存活率明显升高,细胞总坏死率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论牛膝-杜仲药对治疗GIOP具有多成分、多靶点、多途径的特点,可能与其通过槲皮素、山柰酚、黄芩素、β-谷甾醇等活性成分,调控细胞凋亡、自噬、PI3K-Akt、HIF-1等多条信号通路有关。