机械力对骨细胞诱导破骨细胞分化作用的影响

目的评估机械力对骨细胞诱导破骨细胞分化作用的影响。方法对MLO-Y4骨细胞施以12 dyn/cm2流体剪切力,在加力第1、2、4、6、12、24小时,收集加力后的细胞与同源性小鼠骨髓干细胞共存培养,于第9天进行抗酒石酸磷酸酶染色,计数并比较染色阳性的破骨细胞数目。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测不同加力时间点上骨细胞骨保护因子(OPG)和破骨细胞分化因子(RANKL)mRNA表达的时序性变化。结果与未受流体剪切力刺激的骨细胞相比,受力后所有时间点MLO-Y4骨细胞诱导形成的破骨细胞数量均明显降低(P均<0.01)。MLO-Y4骨细胞的OPG mRNA表达在流体剪切力作用12 h内明显升高(P<0.001),RANKL mRNA在流体剪切力作用4 h内明显降低(P<0.05),RANKL/OPG比值在流体剪切力作用12 h内均明显降低(P<0.01);上述变化在加力24 h时与加力前的差异无统计学意义(P>0.05)。结论在12 dyn/cm2流体剪切力负载作用下,MLO-Y4骨细胞表现出抑制骨吸收的骨保护作用。随着机械负载时间延长,这种作用逐渐消失。

槲皮素通过抗骨相关细胞衰老作用治疗雌激素缺乏骨质疏松症的初步研究

目的通过体内外实验探究槲皮素对骨相关细胞衰老的影响,验证槲皮素通过抗骨相关细胞衰老作用对绝经后骨质疏松症的治疗作用。方法选取小鼠骨细胞样细胞MLO-Y4及成骨细胞样细胞MC3T3-E1,构建体外压力诱导的成熟前衰老(stress induced premature senescence, SIPS)模型,通过qRT-PCR法和细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色确定细胞衰老样变化,利用CCK-8法确定槲皮素体外工作浓度,验证槲皮素在骨相关细胞SIPS中的作用。建立去势小鼠骨质疏松模型,槲皮素灌胃给药,与经典雌激素疗法相比较,利用micro-CT扫描分析骨参数及骨微结构的变化,并通过qPCR检测小鼠皮质骨内衰老相关基因p21、p53,衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype, SASP)TNF-α、IL-6以及破骨相关基因TRAP、CTSK和成骨相关基因OCN、RUNX2的表达情况。结果体外实验证明槲皮素能有效抑制骨相关细胞SIPS样改变( P <0.05)。体内实验发现,给药12周后,相较对照组小鼠,槲皮素组小鼠股骨骨表面积与骨体积比值(BS/BV)和骨小梁分离度(Tb.Sp)显著降低( P <0.05),骨小梁数量(Tb.N)显著升高( P < 0.05),骨质疏松程度减轻,较雌激素疗法差异无统计学意义,并伴骨内SIPS相关基因p21、p53及SASP水平下调( P <0.05),成骨水平不受明显抑制。结论槲皮素可通过抑制细胞衰老挽救由雌激素缺乏导致的骨丢失;这可能成为绝经后骨质疏松症治疗的新手段。

牛膝-杜仲药对治疗糖皮质激素性骨质疏松症的网络药理学分析

目的运用网络药理学方法及体外实验探讨牛膝-杜仲药对治疗糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)的作用机制。方法利用TCMSP数据库筛选牛膝-杜仲药对的活性成分并预测其作用靶点;利用DrugBank、GeneCards、OMIM、PharmGkb数据库筛选GIOP疾病相关靶点,并与牛膝-杜仲活性成分作用靶点映射取交集,交集基因即为牛膝-杜仲药对治疗GIOP的潜在作用靶点。采用STRING数据库构建潜在作用靶点的蛋白互作(PPI)网络;利用Cytoscape 3.8.2软件构建“活性成分-潜在作用靶点”网络;通过R 4.1.1软件对潜在作用靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。以牛膝-杜仲(10μg·mL-1)对地塞米松(10-5mol·L^(-1))诱导损伤的MLO-Y4骨细胞进行干预,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果从牛膝、杜仲中分别筛选出20、28个活性成分,预测得到976个作用靶点(牛膝、杜仲共同作用靶点205个),筛选出2006个GIOP疾病相关靶点,最终确定133个牛膝-杜仲药对治疗GIOP的潜在作用靶点。筛选出槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素、β-胡萝卜素、β-谷甾醇、豆甾醇等关键活性成分;得到JUN、FOS、ESR1、MYC、CDKN1A、AKT1、CCND1、CTNNB1、HIF1A、MAPK14、RELA等核心靶点;KEGG通路富集分析得到166条信号通路,筛选得到与GIOP密切相关的细胞增殖、凋亡相关通路及骨代谢相关通路。体外实验结果显示,与模型组比较,牛膝+杜仲组的细胞存活率明显升高,细胞总坏死率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论牛膝-杜仲药对治疗GIOP具有多成分、多靶点、多途径的特点,可能与其通过槲皮素、山柰酚、黄芩素、β-谷甾醇等活性成分,调控细胞凋亡、自噬、PI3K-Akt、HIF-1等多条信号通路有关。