甘蓝自交不亲和基因MLPK与SSP的FISH定位

利用FISH技术,对自交不亲和基因MLPK与SSP在甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸长DNA纤维等3种分辨率水平的靶DNA载体上进行物理定位。结果表明,在有丝分裂前中期,MLPK探针信号位于一对近中着丝粒同源染色体的短臂中部,距着丝粒的百分距离约为53.41±3.16;SSP探针信号位于一对具有随体的近端着丝粒同源染色体的长臂端部,距着丝粒的百分距离约为78.36±4.26。综合3种载体上的FISH结果表明,MLPK与SSP在甘蓝染色体组中可能都只有一个同源序列座位,具有在单倍体基因组中的单拷贝性。重复FISH杂交表明,MLPK与5SrDNA位于同一对染色体。依据Armstrong的核型分析标准,初步判断MLPK与SSP可能分别位于甘蓝的2号和7号染色体,与S位点不存在连锁关系。另从比较基因组学角度对定位结果进行了讨论。

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR以及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对MLPK基因进行扩增克隆,首次得到长度分别为1 615 bp和1 294 bp的基因片段。序列分析表明,甘蓝MLPK与芜菁MLPK的cDNA序列相似性达98%,前者的内含子数为4个,比后者少了3个;同时,在前者内含子中发现了不同于典型的GU-AG规则的新的序列,即第34、个内含子5′端碱基是TA、CG,3′端碱基为CAGG、GT,推测甘蓝MLPK的mRNA具有独特的剪切机制。这为甘蓝自交不亲和分子机理研究提供了新内容。

甘蓝MLPK的原核表达及其互作蛋白分离体系的建立

M–位点受体激酶(MLPK)是甘蓝自交不亲和反应的正向调控关键元件,其参与自交不亲和反应的分子机制尚不明确。为了分离与MLPK相互作用的蛋白,在分析了MLPK功能域的基础上采用PCR技术扩增了MLPK激酶结构域编码序列(记为MLPKK),通过体外定点突变技术构建了两种MLPK失活突变体(记为mlpk1和mlpk2),然后以p ET43.1a为载体构建了原核表达质粒p ET43.1a-MLPKK、p ET43.1a-mlpk1和p ET43.1a-mlpk2,并进行了原核表达和纯化。纯化的融合蛋白p ET43.1a-MLPKK、p ET43.1a-mlpk1和p ET43.1a-mlpk2分别与高度自交不亲和甘蓝‘A4’柱头总蛋白提取液进行孵育,孵育后利用融合蛋白序列中的6×His标签与Ni+结合的特性,钓取MLPK的互作蛋白,建立了分离MLPK互作蛋白的新方法。孵育产物经SDS-PAGE电泳显示,与两个突变体蛋白泳道对比,在p ET43.1a-MLPKK与柱头总蛋白提取液孵育产物的泳道中成功获得了候选的与MLPK互作的蛋白条带,这为后续互作蛋白质谱鉴定以及功能解析提供了技术支持。

转MLPK反义基因对甘蓝自交不亲和性的影响

对反义MLPK基因在甘蓝柱头特异启动子SLR的驱动下,通过农杆菌介导转化法将其导入高度自交不亲和甘蓝材料‘TF’。转基因甘蓝T0代植株定量PCR分析结果显示,不同的转MLPK反义基因单株内源MLPK m RNA积累量具有明显差异,其中转基因植株花期柱头内源MLPK m RNA积累量明显低于野生型对照。花粉原位萌发的荧光显微镜观察结果显示,转基因甘蓝植株花期自交后,吸附在柱头上的花粉粒大量萌发,且穿过柱头的花粉管明显增加,并导致花期自交结籽数上升,转基因植株花期和蕾期自交亲和指数均明显高于野生型对照植株。结果表明,下调MLPK基因表达能部分打破甘蓝自交不亲和,提高其花期自交结籽能力。

芸薹属中自交不亲和反应的信号转导

自交不亲和现象在芸薹属(Brassica)植物中普遍存在,芸薹属中表现的是典型的孢子体型自交不亲和性。单元特异性的S位点受体激酶(SRK)基因和S位点花粉胞被蛋白(SCR/SP11)发生识别后,一系列相关蛋白——臂重复蛋白(ARC1)、M位点蛋白激酶(MLPK)等,引发了自交不亲和反应信号的传导,最终产生自交不亲和反应。文章就这方面的研究进展作介绍。