褪黑素通过上调泛醌―细胞色素C还原酶核心蛋白1抑制MPP^(+)诱导的MN9D细胞凋亡和线粒体损伤

目的探讨褪黑素(melatonin,MT)在1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP^(+))诱导的帕金森病体外模型中的作用及分子机制。方法将MN9D细胞分为对照组、MPP^(+)组、MT组、治疗组。采用细胞计数试剂盒8检测MT和MPP^(+)对细胞活力的影响;采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)评价线粒体功能;Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡;通过免疫荧光蛋白质印迹法(Western blotting)检测凋亡相关蛋白[Cleaved-Caspase 3和细胞色素C(cytochrome C,CytC)]以及泛醌―细胞色素C还原酶核心蛋白1(ubiquinol-cytochrome C reductase core protein 1,UQCRC1)蛋白的表达;采用干扰RNA技术沉默MN9D细胞中UQCRC1的表达,然后采用Western blotting检测凋亡相关蛋白表达。结果MT可以减轻MPP^(+)诱导的细胞活力下降(P<0.05);恢复MPP^(+)造成的线粒体膜电位下降(P<0.05);减少MPP^(+)诱导的凋亡细胞数量(P<0.05);抑制凋亡蛋白(CytC和Cleaved-Caspase3)的表达(P<0.05);上调UQCRC1的表达(P<0.05)。沉默UQCRC1后,MT组和治疗组的UQCRC1表达均下降(P<0.05);MT对MPP^(+)诱导细胞凋亡的保护作用下降(P<0.05);凋亡蛋白(CytC和Cleaved-Caspase3)的表达增加(P<0.05)。结论MT对MPP^(+)诱导的多巴胺能神经元损伤具有保护作用,其机制可能是通过上调UQCRC1抑制神经元凋亡。

Forskolin上调MN9D细胞Nurr1的表达及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响

目的寻找能激活MN9D细胞内源性孤儿核受体(Nurrl)表达的信号分子,研究Nurrl表达增高对酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响,探讨激活Nurrl表达的信号机制。方法用蛋白激酶A激动剂Forskolin或蛋白激酶C激动剂PMA作用于MN9D细胞,用免疫荧光细胞化学及Westernblot方法检测MN9D细胞内源性Nurrl表达的变化,以及Nurrl表达增加对TH表达的影响。利用PKA信号转导通路的特异性抑制剂H89探讨激活Nurrl表达的信号机制。结果1·从加入Forskolin1h起,直至6h,MN9D细胞Nurrl表达比未加Forskolin组明显增加(P<0·05);Forskolin主要增加MN9D细胞核内Nurrl含量,而细胞浆内Nurrl含量变化不明显;Forskolin作用后MN9D细胞TH表达无明显变化。2·用蛋白激酶A的特异性抑制剂H89预处理后,Forskolin仍具有增加Nurrl表达的作用。结论Forskolin可增加MN9D细胞内源性Nurrl表达及核转位,单纯Nurrl表达及核转位增加不影响MN9D细胞TH的表达,TH表达的激活可能还需要其他特殊的细胞(或神经元)环境或共激活因子的共同作用。Forskolin增加MN9D细胞内源性Nurrl表达及核转位的作用不是主要通过激活PKA信号转导通路完成的。

人DAT基因的克隆及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的:探讨人多巴胺(DA)转运体(dopamine transporter,DAT)基因过表达对单胺类递质代谢的效应。方法:从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增DAT cDNA片段,重组于pGEM-T-EASY载体中并进行全序列测定。重组真核表达载体pLNCX2-DAT转染MN9D细胞,Western Blot检测DAT的表达,高压液相(high-performance liquid chromatography,HPLC)法检测细胞内外DA含量的变化。结果:RT-PCR方法扩增得到1981bp的cDNA片段,测序结果表明所得到的片段与DAT序列完全一致;Westein Blot证实转染后的MN9D细胞(实验组)内DAT基因表达明显高于对照组(P<0.05);HPLC结果表明实验组中细胞内外的DA含量明显高于对照组(P<0.05)。结论:DAT高表达明显促进DA的循环和利用,为帕金森病的基因治疗提供了理论依据。

α-突触核蛋白各结构域与MN9D细胞线粒体的关系

目的探讨α-突触核蛋白（α-synuclein）各结构域与MN9D细胞线粒体的关系。方法用PCR方法获得α-synuclein/1~65（N），α-synuclein/61~95（A）及α-synuclein/96~140（C）基因片段，克隆入真核表达质粒pLNCX2，经测序正确后以脂质体转染PT-67细胞，挑取单克隆并扩增，收集上清感染MN9D细胞，分别用Real Time PCR检测细胞基因表达水平，免疫组织化学染色检测蛋白表达，激光扫描共焦显微镜检测蛋白与线粒体共定位，流式细胞术检测细胞状态及线粒体膜电位状态。结果成功构建了pLNCX2/N、pLNCX2/NAC及pLNCX2/C基因片段的重组真核表达质粒，获得了可稳定表达α-synuclein各基因片段的MN9D细胞株。通过激光扫描共焦显微镜观察，可见α-synuclein/N端与线粒体存在共定位关系；α-synuclein/NAC主要在核内聚集表达；α-synuclein/C端在胞质和胞核内均有表达。JC1染色流式细胞术检测显示，过表达α-synuclein/N实验组细胞线粒体膜电位降低。结论α-synuclein的N端可能定位于线粒体，并参与调节线粒体功能；α-synuclein/NAC虽具有疏水性但却能穿过核膜，聚集在核仁周围；α-synuclein的C端定位于胞质和核内可能参与多种细胞功能。

Nurr1在MN9D细胞中的过表达及其对酪氨酸羟化酶的影响

目的 :观察MN9D细胞中Nurr1的表达和分布及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响。 方法 :应用高压液相色谱、免疫细胞化学、转基因、Westernblot和Northernblot等方法检测了MN9D细胞中多巴胺及其代谢物的水平和Nurr1蛋白在细胞中的分布 ,建立了过表达Nurr1的细胞株并观察了Nurr1过表达对TH基因的影响。结果 :MN9D细胞裂解液中含有大量多巴胺及其代谢物 ;Nurr1蛋白主要分布在MN9D细胞的胞质中 ,尤以核周最多 ;MN9D细胞中有Nurr1的mRNA存在和蛋白质的表达 ;过表达Nurr1的MN9D细胞A1株酪氨酸羟化酶表达增高。结论 :Nurr1与多巴胺能神经元发育有关 ,有可能用于帕金森病的基因治疗。

白介素-1β对MN9D细胞Nurr1及酪氨酸羟化酶表达的影响

利用具有未成熟特性的多巴胺(DA)合成细胞系MN9D,观察白介素-1beta(IL-1β)对MN9D细胞内源性孤儿核受体Nurr1表达的作用,并研究Nurr1表达增高对MN9D细胞酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响,探讨Nurr1调控DA能神经元发育的机制。用20 ng/ml的IL-1β作用于MN9D细胞,于IL-1β作用的2、4、6 h用相差显微镜观察细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学染色及Western blot方法检测IL-1β作用后MN9D细胞内源性Nurr1蛋白表达的变化,以及Nurr1表达变化对MN9D细胞TH表达的影响。结果显示:经20 ng/ml的IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞的形态与未经IL-1β作用的细胞相比没有明显改变。从加入IL-1β2 h起,直至6 h,MN9D细胞Nurr1免疫荧光染色强度比未加IL-1β作用的正常对照组细胞明显增强,但此时MN9D细胞中TH阳性细胞的百分比与正常对照组相比没有明显改变(P>0.05)。Western blot结果显示:20 ng/ml的IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞Nurr1蛋白表达分别为233%、232%和254%,经统计学检验,与正常对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。而IL-1β作用2、4、6 h,MN9D细胞TH蛋白的表达分别为97%、107%和105%,但经统计学检验,与正常对照组相比没有显著性差异(P>0.05)。本研究结果表明,IL-1β在2～6 h可迅速明显激活MN9D细胞内源性Nurr1的表达,但此时单纯Nurr1表达增加并不影响MN9D细胞TH的表达;TH的表达激活可能还需要除Nurr1外的其它特殊的细胞(或神经元)的环境或因子的共同作用。

稳定表达GDNF基因的MN9D细胞可保护多巴胺能神经元

目的：建立一种可同时分泌多巴胺（DA）和GDNF的工程细胞，并研究其在帕金森病（PD）基因治疗中的可能作用。方法：克隆携带Kozak序列的GDNFcDNA，转染至可分泌DA的MN9D细胞系，将此工程细胞和大鼠原代多巴胶能神经元共培养，免疫组化检测DA能神经元。结果：发现该工程细胞可防止DA能神经元退变死亡，并有助于DA能神经元抵抗MPP+的毒性损伤。结论：本文首次将PD防治兼顾策略结合起来构建MN9D工程细胞，结果表明其在PD的基因治疗中可能具有重要的应用价值。

帕金森病基因治疗的理论:VMAT_2基因的表达及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的:获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicularmonoaminetransporter-2,VMAT2)基因,转染至MN9D细胞,通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应。方法:从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM-Easy-T载体中,进行全序列测定。重组真核表达载体pBK-RSV-VMAT2,转染MN9D细胞,免疫细胞化学检测VMAT2的表达,HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化。结果:RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的cDNA片段。原位杂交证实pAAV-VMAT2能在COS7细胞表达;免疫组化证实转基因的MN9D细胞(实验组)VMAT2免疫着色明显高于对照组。HPLC结果表明实验组中细胞内外的多巴胺含量分别升高至(227.2±20.8)%和(302.6±15.7)%(P<0.01),而细胞外HVA、DOPAC分别降低至(48.1±5.3)%和(55.7±4.9)%(P<0.05),细胞内HVA,DOPAC分别升高至(332.1±28.2)%和(1176.8±82.5)%(P<0.01)。结论:克隆了VMAT2cDNA片断,可在真核细胞中表达。该基因的过表达可促进多巴胺的循环利用,有望用于帕金森病的基因治疗。

褐藻多糖硫酸酯对1-甲基4-苯基吡啶离子损伤的MN9D细胞内氧化应激及组织蛋白酶D-单克隆凋亡相关蛋白的作用

目的探讨褐藻多糖硫酸酯(FUC)对1-甲基4-苯基吡啶离子(MPP+)损伤的MN9D细胞内氧化应激及组织蛋白酶D(CatD)单克隆凋亡相关蛋白的作用。方法采用100 mol/L MPP+损伤MN9D细胞制备帕金森病(PD)细胞模型。观察FUC预处理后PD细胞模型的细胞存活率。采用荧光检测法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSH)抑制率。采用Western blot法检测CatD、自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ)及Bax蛋白表达。结果与MPP^+组比较,1×10^(-6)、10^(-5)、10^(-4)mol/L FUC预处理细胞存活率均显著升高(均P<0.01)。与对照组比较,MPP^+组SOD、GSH抑制率显著降低(均P<0.05)。与MPP+组比较,FUC预保护组及SEL预保护组SOD、GSH抑制率显著升高(均P<0.01)。FUC预保护组与SEL预保护组SOD、GSH抑制率比较差异无统计学意义。MPP^+组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平表达显著高于对照组(均P<0.001)。FUC预保护组、SEL预保护组及CatD抑制剂组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平显著低于MPP+组(均P<0.001)。FUC预保护组、SEL预保护组及CatD抑制剂组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平差异无统计学意义。结论 FUC对PD细胞模型有保护作用,其机制可能为保护细胞溶酶体,抑制CatDBax的表达,抗氧化应激,抑制细胞凋亡。

褐藻多糖硫酸酯对MPP^+损伤的MN9D细胞氧化应激及凋亡的保护作用

目的探讨褐藻多糖硫酸酯(FUC)对帕金森病(PD)细胞模型的保护作用及机制。方法采用100μmol/L MPP+损伤的MN9D细胞制作PD模型,用MTS检测FUC预处理后PD细胞模型的细胞存活率。荧光检测法测定细胞内活性氧(ROS),荧光素酶法检测细胞内Caspase-3的活性变化,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的变化。结果 FUC 100μmol/L作用24 h明显增加了MPP+损伤的MN9D细胞存活率,差异有高度统计学意义(P<0.01);FUC预保护明显降低了MPP+损伤3 h的MN9D细胞内ROS活性及6 h时Caspase-3的表达,差异有高度统计学意义(P<0.01);FUC、司来吉兰预保护后MN9D细胞凋亡相关蛋白Bax表达明显下降,而Bcl-2表达明显增加,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论褐藻多糖硫酸酯可能通过抗氧化、降低Caspase-3表达、抑制细胞凋亡来保护PD细胞模型。

效应性T细胞促进MN9D细胞的凋亡

目的:利用多巴胺合成细胞系MN9D,观察活化的效应性T(effector T,Teff)细胞对MN9D细胞活力和凋亡的影响,探讨Teff细胞对MN9D细胞的损伤作用。方法:免疫磁珠分选获得Teff细胞,经体外活化后,与MN9D细胞株共培养,然后用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测MN9D细胞的活性;TUNEL和Hoechst染色观察MN9D细胞的凋亡及细胞数目的变化;Western Blot法检测MN9D细胞中活化的caspase-3和caspase-9的表达。结果 :经体外活化的Teff细胞与MN9D细胞共培养后,MN9D细胞的活性明显降低,MN9D细胞的数目显著降低、凋亡率明显增加;且MN9D细胞中促凋亡酶caspase-3和caspase-9的活化水平升高。结论:活化的Teff细胞促进了MN9D细胞的凋亡,具有损伤作用。

μ、κ、δ阿片受体及酪氨酸羟化酶在MN9D细胞中的表达

目的：检测多巴胺能性MN9D细胞中是否存在μ、κ、δ 3种阿片类受体及多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（TH）的表达,为建立吗啡依赖MN9D细胞模型奠定基础.方法：培养MN9D细胞后,采用免疫荧光标记观察μ、κ、δ3种受体蛋白表达状态;RT-PCR检测μ、κ、δ3种阿片类受体的mRNA表达;TH免疫荧光标记,观察多巴胺能神经元的表达数量.结果：免疫荧光及PCR结果均显示MN9D细胞中存在μ、κ、δ 3种受体,并且TH阳性细胞的数目明显多于多巴胺能SH-SY5Y细胞系.结论：MN9D细胞中同时存在μ、κ、δ3种阿片受体,可作为吗啡依赖细胞模型使用.

DJ-1可通过增强自噬水平缓解鱼藤酮致MN9D细胞损伤

目的探讨DJ-1对MN9D细胞的保护作用及具体机制。方法在MN9D细胞中瞬时转染DJ-1质粒,利用MTT法及流式细胞术分别检测MN9D细胞活力与凋亡水平。通过激光共聚焦显微镜(confocal)观察LC3自噬点数量。利用Western blot法检测LC3II/LC3I的比值。结果过表达DJ-1能部分恢复鱼藤酮引起的细胞活力下降(P<0.05)且可以减少鱼藤酮引起的MN9D细胞凋亡(P<0.05)。过表达DJ-1增加了鱼藤酮处理的MN9D细胞内荧光点的数量(P<0.001)且使LC3Ⅱ/Ⅰ的比值显著增高(P<0.001),应用3-MA干预后,细胞内荧光点数量回落到基础水平,且LC3Ⅱ/Ⅰ的比值明显降低(P<0.05)。同时应用自噬抑制剂3-MA干预后,DJ-1的细胞保护作用消失。结论 DJ-1通过激活自噬,起保护作用能减轻鱼藤酮引起的毒性。

Th17细胞对MN9D细胞凋亡的影响

目的:利用多巴胺合成的MN9D细胞株,观察Th17细胞对MN9D细胞凋亡和损伤的影响。方法:免疫磁珠分选获得Th17细胞,经体外活化后,与MN9D细胞株共培养,然后用免疫荧光法检测TH阳性细胞数目;TUNEL和Hoechst染色观察MN9D细胞凋亡及细胞数目的变化;Western Blot法检测MN9D细胞中活化的凋亡酶3(caspase-3)的表达。结果:经体外活化的Th17细胞与MN9D细胞共培养后,MN9D细胞数目显著降低,凋亡率明显增加,且MN9D细胞中促凋亡酶caspase-3的活化水平升高。结论:活化的Th17细胞促进了MN9D细胞的凋亡,具有损伤作用。

毛蕊花糖苷抑制Erastin诱导的多巴胺能神经细胞系MN9D细胞铁死亡

背景:近年越来越多的研究证实多巴胺能神经元细胞铁死亡参与了帕金森病的发病,毛蕊花糖苷目前被证实具有抗氧化、抗炎和神经保护作用。目的:探讨毛蕊花糖苷对Erastin诱导的MN9D细胞铁死亡的保护效果及作用机制。方法:以MN9D细胞为研究对象,分为对照组、模型组(20μmol/L Erastin组)、Erastin+1μg/mL毛蕊花糖苷组、Erastin+5μg/mL毛蕊花糖苷组、Erastin+10μg/mL毛蕊花糖苷组。MN9D细胞在CO_(2)恒温培养箱中培养24 h,然后用不同质量浓度毛蕊花糖苷预处理8 h,再加入20μmol/L Erastin诱导24 h后,采用ELISA法检测还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、总铁离子、丙二醛水平,免疫组织化学法检测酪氨酸羟化酶的表达,Western blot法检测酪氨酸羟化酶、核因子红细胞-2相关因子2、血红素加氧酶1、谷胱甘肽过氧化物酶4蛋白表达。结果与结论:(1)与对照组相比,模型组还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶水平明显减少(P<0.05),丙二醛和总铁离子水平明显增加(P<0.05);与模型组相比,毛蕊花糖苷1,5,10μg/mL组还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶水平明显增加(P<0.05),丙二醛和总铁离子水平明减少(P<0.05);(2)与对照组相比,模型组酪氨酸羟化酶阳性细胞面积明显减少(P<0.05);与模型组相比,毛蕊花糖苷1,5,10μg/mL组酪氨酸羟化酶阳性细胞面积明显增加(P<0.05);(3)与对照组相比,模型组酪氨酸羟化酶、核因子红细胞-2相关因子2、血红素加氧酶1、谷胱甘肽过氧化物酶4的蛋白表达明显减少(P<0.05);与模型组相比,毛蕊花糖苷1,5,10μg/mL组酪氨酸羟化酶、核因子红细胞-2相关因子2、血红素加氧酶1、谷胱甘肽过氧化物酶4的蛋白表达明显增加(P<0.05)。结果提示:毛蕊花糖苷对Erastin诱导的MN9D细胞铁死亡具有明显的抑制作用,其机制可能通过作用于核因子红细胞-2相关因子2/血红素加氧酶1/谷胱甘肽过氧化物酶4通路实现的。

MN9D多巴胺能细胞损伤模型的建立

目的建立离体多巴胺(dopamin,DA)能神经细胞系MN9D细胞损伤模型。方法离体细胞培养条件下,于培养液中加入不同浓度6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)作用于MN9D细胞30 min。24 h后,MTT比色法检测MN9D细胞的存活率、Hoechst 33258核染色和流式细胞仪检测MN9D细胞的凋亡变化。结果6-OHDA以浓度依赖性的方式引起MN9D细胞的凋亡,导致细胞存活率降低。200μmol/L浓度的6-OH-DA作用30 min、培养24 h后,MN9D细胞的存活率降低至68.8%左右,凋亡率增高至约37.8%。结论6-OH-DA能够引起MN9D细胞的存活率降低,而凋亡率增高,产生类似帕金森病时的DA能神经细胞损伤的表现。

长链非编码RNA NORAD过表达通过靶向调控miR-132-5p/Bcl-2改善MPP^(+)诱导的帕金森细胞模型损伤实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)NORAD对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP^(+))诱导的帕金森(PD)细胞模型损伤的影响,及其潜在分子作用机制。方法:3 mmol/L的MPP^(+)处理MN9D细胞建立PD细胞损伤模型,MN9D细胞转染lncRNA NORAD过表达载体、miR-132-5p mimics、miR-132-5p inhibitor、Bcl-2 siRNA及相应对照,qRT-PCR检测细胞中lncRNA NORAD、miR-132-5p和Bcl-2 mRNA的表达,Western blot检测细胞中Bcl-2蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡,试剂盒法检测细胞培养液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)的水平,双荧光素酶实验验证lncRNA NORAD、miR-132-5p和Bcl-2之间的靶向关系。结果:MPP^(+)诱导MN9D细胞中lncRNA NORAD、Bcl-2 mRNA和蛋白表达降低,诱导细胞中miR-132-5p表达升高;过表达lncRNA NORAD能够减轻MPP^(+)诱导的MN9D细胞凋亡、氧化应激和炎症,保护MN9D细胞;lncRNA NORAD与miR-132-5p靶向结合,过表达lncRNA NORAD抑制MN9D细胞中miR-132-5p的表达;miR-132-5p mimics共转染能够逆转lncRNA NORAD过表达对MPP^(+)诱导的MN9D细胞损伤的保护作用;miR-132-5p与Bcl-2的3’UTR靶向结合,转染miR-132-5p inhibitor下调MN9D细胞中miR-132-5p的表达,而促进Bcl-2 mRNA和蛋白表达;转染miR-132-5p inhibitor能够减轻MPP^(+)诱导的MN9D细胞凋亡、氧化应激和炎症,保护MN9D细胞,而共转染Bcl-2 siRNA则能逆转miR-132-5p inhibitor对MPP^(+)诱导的MN9D细胞损伤的保护作用。结论:lncRNA NORAD过表达可通过靶向调控miR-132-5p/Bcl-2,减轻MPP^(+)诱导的MN9D细胞凋亡、氧化应激和炎症,对MN9D细胞损伤具有保护作用。

西玛津对MN9D细胞增殖影响

目的探讨西玛津(Simazine)对多巴胺能神经前体细胞系(MN9D)细胞增殖的影响。方法选择MN9D细胞,分别以50、300、600μmol/L西玛津染毒,同时设溶剂对照及空白对照,采用噻唑蓝(MTT)法检测西玛津对MN9D细胞生存率影响;利用倒置显微镜观察染毒后细胞形态改变。结果西玛津能破坏体外培养MN9D细胞形态、抑制其生长和分化;高剂量西玛津染毒12、24、36、48、60、72 h时,MN9D细胞存活率分别为(85.62±1.07)%、(71.92±0.43)%、(67.42±0.45)%、(60.04±0.11)%、(48.71±0.76)%、(40.63±0.86)%,与溶剂对照组比较,高剂量西玛津染毒组在染毒各时段细胞存活率均降低(P<0.01);各剂量组细胞存活率随染毒时间增大而下降,并具有剂量-反应关系(P<0.01)。结论除草剂西玛津对MN9D细胞有增殖毒性。

木犀草素抗鱼藤酮致小鼠多巴胺能细胞损伤机制的研究

目的观察木犀草素减轻鱼藤酮对小鼠多巴胺能神经母细胞瘤细胞系MN9D细胞的损伤并探讨可能的机制。方法将MN9D细胞分为对照组、鱼藤酮组、木犀草素组和鱼藤酮+木犀草素组。通过细胞增殖实验检测24、48及72h后细胞活力;使用凋亡试剂盒检测细胞凋亡水平;通过2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色检测活性氧的水平,通过蛋白印迹实验检测蛋白磷酸化酶2A(proteinphosphatase 2A,PP2A)的磷酸化水平。结果鱼藤酮组MN9D细胞活力在24、48及72h分别下降至对照组的84.3±6.2%,67.6±5.7%和54.4±4.1%;而鱼藤酮+木犀草素组则为95.3±7.4%,84.7±6.4%和74.3±5.9%(P<0.05)。鱼藤酮组Annexin V阳性细胞数为总细胞数的14.1±3.7%,鱼藤酮+木犀草素组为6.8±2.4%;而PI阳性细胞分别为9.2±2.7%和5.5±2.1%(P<0.05)。鱼藤酮组活性氧平均荧光强度较对照组升高3.4±0.7倍,而鱼藤酮+木犀草素组的活性氧荧光强度仅为鱼藤酮组的42±13%(P<0.05)。鱼藤酮组PP2A的磷酸化水平增加为对照组的182±34%,而鱼藤酮+木犀草素组为对照组的119±21%(P<0.05)。结论木犀草素可以降低鱼藤酮引起的氧化应激反应,对MN9D发挥保护作用。

FKBP38可调控多巴胺能神经元的凋亡

目的研究FKBP38在鱼藤酮诱导的帕金森病(Parkinson’s disease PD)细胞模型中抑制凋亡的作用。方法体内实验:构建MPTP所致的PD体内模型,检测PD小鼠脑中α-synuclein、TH和FKBP38的表达。体外实验:使用鱼藤酮刺激多巴胺能神经元MN9D细胞构建PD体外模型;采用Western blot检测PD体外模型中α-synuclein、TH、Tom20和FKBP38的表达水平;将FKBP38慢病毒转入MN9D细胞构建稳定过表达及敲减FKBP38的细胞株;采用CCK-8法检测过表达及敲减FKBP38的细胞在受到鱼藤酮刺激后的细胞活力;通过Western blot检测PD细胞模型中抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax的表达水平。结果在PD体内外模型中,FKBP38蛋白表达水平均明显地下调(P<0.01)。而敲减FKBP38后加剧了鱼藤酮造成的多巴胺能神经元细胞活力下降(P<0.05),而过表达FKBP38却可明显地改善鱼藤酮造成的多巴胺能神经元细胞活力下降(P<0.05),并且,Western blot结果表明,过表达FKBP38可明显地上调PD多巴胺能神经元中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平及升高Bcl-2/Bax的比值(P<0.05)。结论在PD细胞模型中,调控FKBP38可改善多巴胺能神经元凋亡。