基于MOMP衣原体疫苗的研究进展

主要外膜蛋白(MOMP)是衣原体外膜复合物的主要成分,与衣原体的免疫原性、侵袭力及毒力密切相关,是衣原体的主要疫苗候选抗原。本文主要对MOMP及其相关疫苗研究进行综述,以望为靶向MOMP的新型或临床衣原体疫苗研发提供理论依据。

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。

嗜肺军团菌重组MOMP蛋白间接ELISA方法的建立及其在血清学诊断中的应用

目的表达及纯化出嗜肺军团菌主要外膜蛋白(MOMP)作为诊断抗原,研究其在嗜肺军团菌感染血清学诊断中的实用价值。方法将已成功构建的重组质粒pET-momp转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中,诱导重组MOMP表达,运用SDS-PAGE和亲和层析法纯化。用DRG军团菌IgG、IgM、IgA的ELISA试剂盒筛选出58份阳性血清和32份阴性血清,用纯化的MOMP蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA,同时与R&D公司军团菌的IgG、IgM、IgA ELISA试剂盒分别检测已筛选血清中的IgG、IgM、IgA抗体,然后用受试者工作特征(ROC)曲线对这2种方法进行比较,通过敏感性、特异性以及检测结果的一致性,来评价重组MOMP间接ELISA的应用价值。结果成功诱导表达并纯化出相对分子质量(M r)大约为45 000的重组MOMP蛋白。重组MOMP建立的间接ELISA分别检测筛选血清中IgG、IgM、IgA抗体与R&D公司的ELISA试剂盒进行比较,IgG抗体灵敏度90.9%,特异度91.7%,一致性Kappa值0.784(P<0.05),ROC曲线下的面积0.913;IgM抗体灵敏度91.4%,特异度90.6%,一致性Kappa值0.809(P<0.05),ROC曲线下的面积为0.910;IgA抗体灵敏度92.1%,特异度88.9%,一致性Kappa值0.793(P<0.05),ROC曲线下的面积0.905。结论成功诱导表达及纯化出重组MOMP蛋白,将其作为诊断抗原所建立的间接ELISA表现出了较好的特异性,灵敏度和一致性,为军团病的血清学诊断试剂盒的研制奠定了基础。

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的:构建E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法:根据Genebank中E型CtMOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAII载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Westernblotting方法鉴定表达产物。结果:从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论:成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。

禽源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

对从疑似禽衣原体病鸡分离鉴定的鹦鹉热衣原体用PCR方法扩增,获得了完整的外膜主蛋白(MOMP)基因,将其克隆到pMD 18-T Simple载体中,用BglⅡ和SalⅠ双酶切出目的基因,并将其与已线性化的pshuttle-CMV穿梭载体连接。然后,将阳性质粒转化入含有腺病毒骨架载体的BJ5183感受态细胞中进行同源重组。将同源重组的腺病毒粒子转入DH5α大肠埃希氏菌增殖。提取同源重组后的腺病毒粒子转染AD-293细胞,待重组腺病毒在AD-293细胞中传代稳定后,经PCR技术检测,扩增到了MOMP目的基因;用间接免疫荧光试验检测,呈阳性反应,证明目的蛋白得到了表达。经测定,重组腺病毒的效价达3.9×1010PFU/mL。

一种基于momp基因的衣原体分子生物学甄别技术的初步建立

目的利用PCR方法建立一种基于momp基因的衣原体分子甄别方法。方法根据衣原体momp基因的恒定区和可变区分别设计衣原体科特异性引物和种特异性引物,利用PCR方法对本实验室保存的衣原体进行扩增,以达到甄别的目的。利用限制性片段长度多态性(RFLP)分析科特异性PCR扩增产物,研究momp基因的多态性。结果利用建立的PCR方法对本实验室保存的九株衣原体进行了研究,结果表明八株衣原体都是鹦鹉热嗜衣原体,一株为沙眼衣原体。利用限制性片段长度多态性(RFLP)分析科特异性PCR扩增产物,分析了D34、B11001、CW2和CP12四株衣原体,结果可以产生两种不同的带型。结论利用建立的PCR方法可以达到检测甄别衣原体的目的,并可以通过RFLP分析衣原体的侵袭性。

衣原体MOMP蛋白生物多态性及细胞表位分析

目的:预测并分析比较衣原体MOMP蛋白的二级结构和B细胞表位。方法:以各株衣原体MOMP蛋白的氨基酸序列为基础,采用Gamier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测蛋白二级结构;按Kyte-Doolittle法、Emini法和Jame-son-Wolf法预测蛋白的抗原表位;以ClustalX软件序列比对分析其多变区。结果:各株MOMP蛋白含多个抗原位点,各序列在第80-107、165-178、249-264、332-346位序列高度差异,并出现比对"空沟"。多个强表位位于序列保守区内。结论:MOMP蛋白有较强的免疫原性,预测的抗原位点为之后蛋白相互作用研究、单抗制备、亚单位疫苗设计提供了理论依据。

嗜肺军团菌momp基因疫苗的制备及其免疫原性研究

目的构建真核重组质粒GFP-momp作为核酸疫苗,已构建的原核重组质粒pET-momp表达的蛋白作为蛋白疫苗,二者联合免疫BALB/c雌性小鼠,观察其免疫原性。方法 (1)以嗜肺军团菌DNA作为模板,扩增得到momp基因,并克隆至pEGFP-C1载体获得重组质粒GFP-momp。鉴定正确后,将其转染到NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察GFP-momp的表达。(2)选取BALB/c雌性小鼠60只,平均分为4组,即磷酸盐缓冲液(PBS)组(A组)、空质粒pEGFP-C1组(B组)、DNA疫苗组(C组)、联合疫苗组(D组)。以重组质粒GFP-momp作为DNA疫苗,重组质粒GFP-momp和MOMP蛋白作为联合疫苗,第1天A组肌肉注射PBS 50μL,B组注射pEGFP-C1 50μg,C、D组各注射GFP-momp50μg;第14天各组以相同剂量追加免疫1次;第21天A、B、C组用相同剂量再追加免疫1次,D组注射10μg纯化的MOMP蛋白。借助对各试验组小鼠的抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性等指标的动态检测,来评价DNA疫苗与蛋白疫苗的免疫原性。结果扩增出831bp的momp基因,构建重组质粒GFP-momp,转染入NIH3T3细胞并在细胞内表达出绿色荧光蛋白。在淋巴细胞增殖试验中:A组和B组比较差异无统计学意义(P>0.05);C组和D组淋巴细胞增殖活性均高于B组,差异有统计学意义(P<0.05);C组高于D组,差异有统计学意义(P<0.05)。间接ELISA测定血清中抗原特异性抗体水平结果显示,A、B两组比较差异无统计学意义(P>0.05);C、D两组均高于B组,差异有统计学意义(P<0.05);D组抗体滴度高于C组,差异有统计学意义(P<0.05)。CTL杀伤活性试验结果显示,A、B两组比较差异无统计学意义(P>0.05);C、D两组均高于B组,差异有统计学意义(P<0.05);D组杀伤活性高于C组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建momp基因的真核表达载体并在NIH3T3细胞中得到表达,并进一步得出嗜肺军团菌momp基因诱导产生的DNA疫苗和DNA-蛋白疫苗均能产生细胞免疫和体液免疫,具有免疫原性。

鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒的稳定性及SPF雏鸡免疫试验

目的:检测重组腺病毒质粒在HEK293细胞中的稳定性;重组腺病毒是否与减蛋综合征阳性血清发生中和反应,以及用重组腺病毒免疫SPF小鸡是否产生保护.方法:将重组腺病毒质粒在HEK293细胞中连续传代,并用PCR法检测目的基因;用减蛋综合征阳性血清在体外中和重组腺病毒,接种HEK293细胞;用重组腺病毒免疫SPF小鸡,然后用CpL菌株攻击.结果:重组腺病毒质粒在HEK293细胞中连续传代后,仍然用PCR检测能检测出目的基因;重组腺病毒与减蛋综合征阳性血清之间无交叉反应;用重组腺病毒免疫SPF鸡,用CpL菌株攻击,90%的小鸡获得了保护.结论:重组腺病毒质粒在HEK293细胞中能稳定传代;重组腺病毒不受减蛋综合征阳性血清的影响;用重组腺病毒免疫SPF小鸡,能够获得保护.

沙眼衣原体D型MOMP基因原核表达载体的构建及序列分析

目的:构建沙眼衣原体D型MOMP基因的原核表达载体,为沙眼衣原体基因工程疫苗的研究提供材料。方法:PCR技术扩增D型沙眼衣原体标准株的MOMP基因片段,将其定向插入原核表达载体pRSET多克隆位点中,构建重组表达载体。并用酶切分析、PCR扩增及序列测定方法对重组载体进行鉴定。结果:沙眼衣原体MOMP基因被正确克隆到原核表达载体pRSET-A中,测序结果与Genebank中AF279589等菌株序列有99.99%同源性。结论:原核表达载体pRSET-MOMP构建成功。

嗜肺军团菌momp原核重组质粒的构建和表达

目的构建嗜肺军团菌momp原核重组质粒,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌LP1型DNA为模板,PCR扩增得到momp基因,定向克隆至原核载体PET32a(+)中,经酶切及测序鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导并用SDS-PAGE电泳进行分析,其产物用亲和层析法进行纯化。结果扩增出831bp的momp基因,构建重组质粒pET-momp,诱导表达及纯化出50KD的蛋白。结论成功构建momp基因的原核表达载体并得到高效表达。

羊流产嗜性衣原体MOMP基因的克隆及序列分析

为探讨羊流产嗜性衣原体MOMP蛋白的生物学功能、揭示其在流产衣原体病诊断和防治中的作用。本试验根据Gen Bank公布的流产嗜性衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因序列,设计并合成4条特异性引物,以羊流产嗜性衣原体青海分离株感染的鸡胚卵黄囊中提取的衣原体基因组为模板,应用套式PCR扩增到MOMP全基因序列。通过生物信息学软件对该基因的结构及其推导的氨基酸序列进行了预测分析,同时分析了与其他流产嗜性衣原体的同源性。结果显示,该基因全长1 170 bp,可编码389个氨基酸,蛋白分子量理论值为41.8 ku,理论等电点7.54,编码蛋白理化性质较稳定。其第1位到第19位氨基酸残基为信号肽序列,具有3处N-糖基化位点。含有多个能被其他酶修饰的位点,以无规则卷曲为主,含5个跨膜区,3个亲水性较强的抗原表位。同源性分析表明与其他流产嗜性衣原体分离株的一致性高在93%以上,系统进化分析表明与OCLH196株(序列号为AJ440239)位于同一进化分支。

pEGFP/MOMP真核表达重组体的构建及表达

目的:克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因,构建pEGFP/MOMP真核表达重组质粒,为沙眼衣原体核酸疫苗的研制提供依据。方法:用PCR方法从D型Ct基因组中扩增MOMP全基因片段,克隆入真核表达载体pEGFP相应的酶切位点中,阳性重组子经BamHI、KpnI双酶切、PCR扩增及测序鉴定;并经脂质体介导转染HeLa细胞,36h后观察瞬时表达情况。结果:PCR扩增得到约1.2kb的特异性MOMP基因片段;序列测定证实与GenBank登录的D型沙眼衣原体一致;筛选鉴定出真核表达重组体pEGFP/MOMP。结论:成功地构建了pEGFP/MOMP真核表达重组体,并在HeLa细胞中表达了MOMP。

猪流产嗜性衣原体MOMP基因的克隆及原核表达

【目的】克隆猪流产嗜性衣原体青海株主要外膜蛋白(Major outer membrane protein,MOMP)基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的猪流产嗜性衣原体MOMP基因的核苷酸序列,设计并合成4条特异性引物,用套式PCR方法扩增猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,将其克隆入pMD18-T载体中,进行测序及序列分析。然后将MOMP基因亚克隆入原核表达载体pGEX4T-1中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测。【结果】扩增到猪流产嗜性衣原体青海株1170bp的MOMP全长基因。序列分析结果表明,该基因与已发表的猪流产嗜性衣原体B11001株和CP/12株核苷酸同源性均为99.7%。SDS-PAGE电泳可检测到分子质量约为66ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在。Western-blot分析表明,重组蛋白可被猪流产嗜性衣原体抗体识别。【结论】成功克隆了猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,并进行了原核表达,表达的蛋白具有抗原活性。

嗜肺军团菌MOMP通过激活NOD2/RIP2信号通路抑制RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能并增强其趋化能力

目的探讨嗜肺军团菌主要外膜蛋白(MOMP)对RAW264. 7巨噬细胞吞噬功能和趋化功能的影响并探讨其机制。方法采用MOMP与RAW264. 7巨噬细胞进行体外共培养,用CCK-8法检测MOMP对RAW264. 7巨噬细胞的毒性,确定半数抑制浓度(IC50)。采用(1. 14、0. 57、0. 28)μg/m L MOMP分别处理RAW264. 7巨噬细胞,并设细胞对照组。RAW264. 7巨噬细胞处理24、48、72 h,收集细胞和培养上清,用中性红吞噬实验检测巨噬细胞的吞噬功能;用TranswellTM小室检测巨噬细胞的趋化功能; ELISA检测细胞培养上清单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白细胞介素10(IL-10)的含量;实时定量PCR检测巨噬细胞核苷酸结合寡聚结构域1(NOD1)、NOD2、受体相互作用蛋白2(RIP2) mRNA水平,Western blot法检测NOD1、NOD2、RIP2的蛋白水平。结果 CCK-8法检测MOMP对RAW264. 7巨噬细胞的IC_(50)为5. 69μg/m L;与对照细胞相比,MOMP处理引起RAW264. 7巨噬细胞吞噬功能降低且呈剂量和时间依赖性;随着MOMP剂量的增加,巨噬细胞的趋化能力及细胞培养上清中MCP-1、IL-10的分泌水平增加,并在36 h达到峰值; NOD2、RIP2的mRNA和蛋白表达水平也增加,NOD2和RIP2的mRNA水平在12 h达到高峰,蛋白水平在24 h达到峰值。结论 MOMP抑制RAW264. 7巨噬细胞的吞噬功能并增强其趋化功能,与激活NOD2/RIP2信号通路有关。

猪源嗜性衣原体HB1043株主要外膜蛋白(MOMP)基因的分析及重组表达

根据GenBank中衣原体主要外膜蛋白(MOMP)全基因序列设计特异性引物,以临床分离的衣原体病原中提取的衣原体全基因组为模板,利用特异性引物PCR扩增得到MOMP全基因序列。通过BLAST比对,结果显示其与已提交的猪流产衣原体CG1株的MOMP序列(EU531729)有1个碱基不同。根据对测序结果进行信号肽序列预测及内切酶位点分析,选用BamHⅠ和SalⅠ双酶切将目的蛋白序列克隆到表达载体pET-28a上,得到重组质粒pET-28a-MOMP。将重组质粒转化入E.coli BL21进行表达,表达产物使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到目的蛋白rMOMP。目的蛋白经Western-blot检测,证明其具有免疫学活性。

肺炎嗜衣原体MOMP基因的克隆与原核表达

克隆了肺炎嗜衣原体外膜主蛋白(major out membrane protein,MOMP)基因,并进行了原核表达。根据GenBank公布的肺炎嗜衣原体MOMP基因序列,设计克隆引物后用普通PCR方法扩增出肺炎嗜衣原体MOMP基因的完整片段,将其克隆到pMD-19T后进行测序,经序列比对正确后将此片段亚克隆到表达载体pET-32a(+)中,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,再采用SDS-PAGE和Western-Blot检测重组蛋白的表达情况。结果表明:本研究克隆了肺炎嗜衣原体MOMP基因并在原核系统中成功表达了MOMP重组蛋白,且WesternBlot显示该重组蛋白具有免疫学活性。

荧光标记MOMP抗体检测沙眼衣原体的方法及性能评价

目的建立异硫氰酸荧光素标记沙眼衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体直接免疫荧光法检测沙眼衣原体的方法,并评价其灵敏度和特异性。方法双盲法。采集女性宫颈拭子双份,一份免疫荧光法检测,另一份采用荧光定量PCR检测。以PCR测定结果作为标准,分别计算DFA和PCR结果的一致性。结果共检测142份宫颈拭子,准确率为99.3%,其中阳性符合率为90.9%,阴性符合率为100%。Kappa系数一致性检验,k为0.894。荧光标记MOMP抗体检测沙眼衣原体灵敏度、特异性与PCR两种方法检测结果一致。结论异硫氰酸标记沙眼衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体法检测沙眼衣原体有较高的灵敏度和特异性,可用于临床检验。

女性生殖道沙眼衣原体感染与发育周期MOMP抗原表达的关系

目的:为了解沙眼衣原体的发育周期、MOMP抗原表达、临床症状间的关系。方法:用PCR技术与CT选择培养基检测了302例妇科性病就诊者的CT感染情况。结果:PCR阳性率23.18％(70/302)>培养阳性率16.16％(50/302);70例PCR阳性标本中,培养结果为阳性(50例,Ⅰ组),阴性(12例,Ⅱ组),污染(8例,Ⅲ组)。Ⅰ与Ⅱ组、Ⅱ与Ⅲ组的临床症状发生率存在显著差异,Ⅰ与Ⅲ组的不明显。结论:CT蜇伏于变异网状体期时,培养阴性,临床症状不明显,但PCR阳性,此时CT逃避宿主的免疫应答,成为潜在感染源和复发的主要原因。

沙眼衣原体MOMP基因真核表达载体免疫小鼠的研究

目的 用pcDNA3-MOMP真核表达质粒直接免疫小鼠 ,观察小鼠对沙眼衣原体MOMP基因疫苗的免疫应答。方法 大量制备重组质粒 pcDNA3-MOMP ,给小鼠肌肉注射 ,每 3周免疫 1次 ,共免疫 3次。用微量免疫荧光及MTT法检测小鼠血清抗体及脾细胞对沙眼衣原体的特异性增殖反应。结果 初次免疫接种后小鼠血清中检测出特异性抗体 ,加强免疫后抗体水平明显上升 ,免疫荧光滴度最高达 1∶2 5 6。脾细胞对沙眼衣原体的刺激指数明显高于对照组 (P <0 0 1)。结论 pcDNA3-MOMP在小鼠体内既可诱导体液免疫应答 ,又可诱导特异性细胞免疫应答。