嗜肺军团菌重组MOMP蛋白间接ELISA方法的建立及其在血清学诊断中的应用

目的表达及纯化出嗜肺军团菌主要外膜蛋白(MOMP)作为诊断抗原,研究其在嗜肺军团菌感染血清学诊断中的实用价值。方法将已成功构建的重组质粒pET-momp转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中,诱导重组MOMP表达,运用SDS-PAGE和亲和层析法纯化。用DRG军团菌IgG、IgM、IgA的ELISA试剂盒筛选出58份阳性血清和32份阴性血清,用纯化的MOMP蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA,同时与R&D公司军团菌的IgG、IgM、IgA ELISA试剂盒分别检测已筛选血清中的IgG、IgM、IgA抗体,然后用受试者工作特征(ROC)曲线对这2种方法进行比较,通过敏感性、特异性以及检测结果的一致性,来评价重组MOMP间接ELISA的应用价值。结果成功诱导表达并纯化出相对分子质量(M r)大约为45 000的重组MOMP蛋白。重组MOMP建立的间接ELISA分别检测筛选血清中IgG、IgM、IgA抗体与R&D公司的ELISA试剂盒进行比较,IgG抗体灵敏度90.9%,特异度91.7%,一致性Kappa值0.784(P<0.05),ROC曲线下的面积0.913;IgM抗体灵敏度91.4%,特异度90.6%,一致性Kappa值0.809(P<0.05),ROC曲线下的面积为0.910;IgA抗体灵敏度92.1%,特异度88.9%,一致性Kappa值0.793(P<0.05),ROC曲线下的面积0.905。结论成功诱导表达及纯化出重组MOMP蛋白,将其作为诊断抗原所建立的间接ELISA表现出了较好的特异性,灵敏度和一致性,为军团病的血清学诊断试剂盒的研制奠定了基础。

衣原体MOMP蛋白生物多态性及细胞表位分析

目的:预测并分析比较衣原体MOMP蛋白的二级结构和B细胞表位。方法:以各株衣原体MOMP蛋白的氨基酸序列为基础,采用Gamier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测蛋白二级结构;按Kyte-Doolittle法、Emini法和Jame-son-Wolf法预测蛋白的抗原表位;以ClustalX软件序列比对分析其多变区。结果:各株MOMP蛋白含多个抗原位点,各序列在第80-107、165-178、249-264、332-346位序列高度差异,并出现比对"空沟"。多个强表位位于序列保守区内。结论:MOMP蛋白有较强的免疫原性,预测的抗原位点为之后蛋白相互作用研究、单抗制备、亚单位疫苗设计提供了理论依据。

嗜肺军团菌MOMP通过激活NOD2/RIP2信号通路抑制RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能并增强其趋化能力

目的探讨嗜肺军团菌主要外膜蛋白(MOMP)对RAW264. 7巨噬细胞吞噬功能和趋化功能的影响并探讨其机制。方法采用MOMP与RAW264. 7巨噬细胞进行体外共培养,用CCK-8法检测MOMP对RAW264. 7巨噬细胞的毒性,确定半数抑制浓度(IC50)。采用(1. 14、0. 57、0. 28)μg/m L MOMP分别处理RAW264. 7巨噬细胞,并设细胞对照组。RAW264. 7巨噬细胞处理24、48、72 h,收集细胞和培养上清,用中性红吞噬实验检测巨噬细胞的吞噬功能;用TranswellTM小室检测巨噬细胞的趋化功能; ELISA检测细胞培养上清单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白细胞介素10(IL-10)的含量;实时定量PCR检测巨噬细胞核苷酸结合寡聚结构域1(NOD1)、NOD2、受体相互作用蛋白2(RIP2) mRNA水平,Western blot法检测NOD1、NOD2、RIP2的蛋白水平。结果 CCK-8法检测MOMP对RAW264. 7巨噬细胞的IC_(50)为5. 69μg/m L;与对照细胞相比,MOMP处理引起RAW264. 7巨噬细胞吞噬功能降低且呈剂量和时间依赖性;随着MOMP剂量的增加,巨噬细胞的趋化能力及细胞培养上清中MCP-1、IL-10的分泌水平增加,并在36 h达到峰值; NOD2、RIP2的mRNA和蛋白表达水平也增加,NOD2和RIP2的mRNA水平在12 h达到高峰,蛋白水平在24 h达到峰值。结论 MOMP抑制RAW264. 7巨噬细胞的吞噬功能并增强其趋化功能,与激活NOD2/RIP2信号通路有关。

绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测绵羊家畜衣原体血清抗体的间接ELISA方法,本试验构建pET-28b-ompA重组表达质粒,经诱导表达和纯化后,对重组主要外膜蛋白(MOMP)进行Western blot鉴定;以MOMP为包被抗原,通过反应条件筛选建立绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、重复性和符合性,并进行临床样品检测。结果显示,MOMP以包涵体形式表达,经Western blot鉴定重组蛋白具有良好的反应原性。优化反应条件为:抗原包被浓度为1 mg/L,37℃静置孵育1 h;血清抗体稀释倍数为1∶100,37℃反应1 h;酶标二抗稀释倍数为1∶5000,37℃孵育1 h;底物显色条件为37℃避光5 min。利用52份绵羊血清确定ELISA方法的阳性判定临界值为P/N=2.156。该方法的敏感性、特异性和重复性较高。用该方法与间接血凝试验对86份血清进行检测,两者符合率为73.2%。用该方法对临床采集的205份绵羊血清样品进行检测,阳性率为34.1%。结果表明,本试验建立的绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法具有较高的特异性和敏感性,可应用于临床检测。

嗜水气单胞菌主要外膜蛋白对欧洲鳗鲡的免疫保护试验

制备出4株分属3个不同血清型嗜水气单胞菌的主要外膜蛋白(MOMP)免疫刺激复合物(ISCOMs)亚单位疫苗,腹腔注射免疫欧洲鳗鲡,ELISA法测得免疫后第14d和第30d所采集的血清的平均抗体效价在1∶320—1∶1280之间。免疫印迹结果显示,在印迹膜上对应的位置均可检测到MOMP的主要蛋白条带。第40d的免疫保护试验表明,免疫欧鳗对TPS-30菌株约100倍半数致死剂量的攻击无免疫保护作用,其中的3组被测免疫欧鳗对TPS-30菌株约10倍半数致死剂量的攻击的免疫保护率皆在80%以上。上述试验结果提示,嗜水气单胞菌的主要外膜蛋白是重要的保护性抗原,在制备成ISCOMs亚单位疫苗的情况下,较小的剂量免疫一次即可显示出较高的相对免疫保护率,且没有明显的血清型特异性。

电泳和免疫印迹分析副溶血弧菌和溶藻弧菌主要外膜蛋白和多糖抗原

目的 考察副溶血弧菌和溶藻弧菌的主要外膜蛋白 (MOMP)及其多糖抗原 (PSA)在不同菌株间的结构特征及其免疫学特性 ,从而进一步揭示其共同的保护性抗原。方法 一步超速离心法和蛋白酶K消化法分别制备 10株副溶血弧菌和7株溶藻弧菌的MOMP和PSA ,SDS -PAGE和免疫印迹分析其结构特点。结果 两种细菌的MOMP和PSA的结构和形态菌株间差别明显 ,但也有MOMP一致的菌株 ,免疫印迹显示 ,全部的 10株副溶血弧菌和 5株溶藻弧菌都具有分子量约为36kD的主要外膜蛋白 ,他们能够被副溶血弧菌全菌抗血清所识别 ,是两种细菌共同的具有强免疫原性的主要抗原。PSA分析未见经典LPS的O侧链结构。多糖成份在菌株间的交叉反应有限 ,可能受弧菌自身表面抗原复杂性的影响 ,凝集反应结果与免疫印迹试验结果不完全一致。此外 ,副溶血弧菌与溶藻弧菌的PSA也会产生免疫学上的交叉反应。结论 36kD的MOMP是广泛存在于副溶血弧菌和溶藻弧菌的高丰度蛋白 ;与主要外膜蛋白相比 ,多糖抗原在菌株间具有更大的异质性 ;副溶血弧菌和溶藻弧菌的MOMP可能比PSA更具研制疫苗潜力。

E血清型沙眼衣原体主要外膜蛋白B细胞表位的预测

基于E血清型沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）主要外膜蛋白（Major outer membrane protein，MOMP）氨基酸序列，采用Hopp-Woods的亲水性方案、Emini表面可及性方案、Jameson-Wolf抗原指数方案和Janin可及性方案等，辅以对MOMP蛋白的二级结构中的柔性区域及跨膜区域的分析，预测CTMOMP蛋白的B细胞表位。推测最有可能的B细胞表位位于MOMP蛋白N端第73～81区段、217～225区段、第377～386区段、第261～270区段和第161～175区段内或它们的附近。用多参数预测CTMOMP蛋白的B细胞表位，为进一步研究蛋白特性及表位疫苗研制奠定了基础。

鳗源嗜水气单胞菌L316主要外膜蛋白基因克隆和序列分析

根据已发表嗜水气单胞菌(AH)的外膜蛋白基因(Omp)的核苷酸序列设计1对特异性引物,应用PCR 技术,扩增AHL316的主要外膜蛋白基因(Momp),经T/A克隆,插入到pGEM—T系列载体上进行序列测定,结果表明Momp基因最长的开放阅读框(ORF)为1 035 nt,编码由分子量为36 kD的主要外膜蛋白(MOMP),其与国外AH分离株AF146597的Omp基因的核苷酸的同源性达96%,氨基酸的同源性达98%。应用分子生物学软件分析表明此主要外膜蛋白前24个氨基酸是较强的疏水性区域,可形成信号肽,有跨膜区,经与其他外膜蛋白系统发育进化分析表明,该蛋白属于ompA蛋白家族。

肺炎衣原体主要外膜蛋白重组抗原制备与应用的研究

目的:为了研究肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae,Cpn)抗原作为特异性诊断试剂,本文应用重组技术研制Cpn主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)重组抗原,用于血清IgG抗体的检测。方法:通过构建和表达CpnMOMP重组抗原,应用包涵体纯化法纯化重组抗原后建立ELISA试验,并检测了82份正常人血清及临床标本207份,其中心血管疾病血清118份,呼吸系统疾病血清59份,其他疾病30份。结果:应用克隆技术,获得纯化的Cpn MOMP重组抗原。用重组抗原检测血清IgG,正常人血清阳性检出率仅为3.7%;而207份病人血清,116份为阳性,总阳性率56.0%。其中心血管疾病血清118份,阳性69份,阳性率58.5%;呼吸系统疾病血清59份,阳性38份,阳性率64.4%;其他疾病患者30份,阳性9份,阳性率仅30.0%。结论:与进口ELISA试剂盒相比阳性率基本相符,统计分析无显著意义,但重组MOMP蛋白的抗原特异性较高,且具有抗原制备较为方便和价廉等特点。由于临床标本数量有限,尚需进一步探索MOMP重组抗原作为Cpn感染疾病的辅助诊断。

沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位免疫血清中和活性分析

目的:制备高效价E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)168多表位特异性免疫血清并研究其免疫学特性。方法:纯化的Trx-his/Ct MOMP168融合蛋白经弗氏佐剂乳化后,小鼠背部皮下多点免疫注射,间隔2周后加强免疫,共3次,并分别于免疫前和每次免疫后2周取血,采用ELISA法检测血清融合蛋白和E型Ct全菌体特异性抗体水平及变化趋势,通过体外中和反应检测多表位特异性血清的免疫学特性。结果:小鼠用Ct MOMP168多表位融合蛋白全程免疫后产生了抗融合蛋白和E型Ct全菌体特异性抗体,ELISA法检测最高滴度达1:500。ELISA和体外中和实验检测结果显示,该抗体能特异性识别MOMP多表位蛋白和E型Ct全菌体,并能有效抑制E型Ct感染Hela229细胞。结论:沙眼衣原体MOMP多表位融合蛋白免疫血清可特异性结合并中和E型Ct。

特异、快速、简便、经济的淋病检测试剂盒的研制

本研究成功地制备了多株淋球菌主要外膜蛋白的单抗，并以胶体金标记。制备兔抗外膜蛋白多抗。在硝酸纤维素膜条上打点包被多抗，加经处理的被检样品和胶体金标记的单抗，直接显色。与细菌培养法一同检测标本312例，两法检测结果符合率力99．36％。结果表明两者特异性、灵敏度基本一致，本试剂稳定性、重复性好，且操作简便，不用仪器，15分钟内即可得到结果。本研究具有很高的特异性和灵敏度，结果适用于快速临床检测。

抗沙眼衣原体主要外膜蛋白种特异性单克隆抗体

用人工合成沙眼衣原体主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）氨基端１／４肽链免疫８周龄雄性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３只，第１４天用Ｌ１／４４０／Ｂｕ原体加强免疫，第２４天将免疫反应良好的１只小鼠脾细胞与ＮＳ－１瘤细胞融合。用１／４ＭＯＭＰ和Ｌ１原体抗原包被的聚丙乙烯板检测上清中抗体，淘汰与鹦鹉热衣原体种（ＥＡＥ株）、肺炎衣原体种（ＡＴＣＣＶＲ１３１０株）以及正常组织培养细胞（ＢＧＭＫ）有交叉反应的克隆，最后得到４株抗沙眼衣原体特异性单克隆抗体（ＭＡｂｓ），其抗体属ＩｓＧ１和ＩｇＧ２ａ亚类。微量免疫荧光试验（ｍｉｃｒｏ－ＩＦ）发现４株ＭＡｂｓ均与本实验室制备的沙眼衣原体Ｌ１、Ｌ２、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ原体及Ｌ２包涵体抗原发生反应，并与沙眼衣原体所有１５个标准血清型结合，其腹水ＭＡｂｓ滴度≥１：１２８００。免疫印迹试验显示４株ＭＡｂｓ均与沙眼衣原体分子量为４００００的ＭＯＭＰ反应。

一种基于鸽源鹦鹉热衣原体MOMP蛋白的抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测鸽源鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)抗体的间接ELISA方法,将Cps的主要外膜蛋白(Major outer membrane protein,MOMP)基因分别克隆至2个原核表达载体,获得了2种带有不同标签的重组蛋白MOMP-GST和MOMP-His,利用MOMP-His重组蛋白免疫制备多克隆抗体,MOMPGST重组蛋白经抗MOMP的家兔源多抗验证后作为包被抗原,经条件优化,建立基于鸽源Cps的MOMP蛋白的间接ELISA方法。结果显示,成功表达了大小约为51 ku的MOMP-His和65 ku的MOMP-GST重组蛋白,制备的抗MOMP家兔源多克隆抗体效价在1∶409 600以上。该ELISA方法的最适条件为:抗原包被质量浓度为0.5 mg/L,抗原包被液为CBS,抗原包被条件为37℃1 h;封闭液为50 mL/L FBS,封闭条件为37℃2 h;血清稀释度为1∶200,血清孵育时间为30 min;酶标二抗稀释度为1∶8 000,酶标二抗孵育时间为1 h;底物反应时间为5 min。特异性试验结果显示,该方法仅能检测鸽源Cps阳性血清,与鸽Ⅰ型副黏病毒等其他常见鸽病毒阳性血清均无交叉反应。敏感性试验结果显示,当鸽阳性血清稀释到1∶1 600时检测结果仍为阳性,且批内批间的重复变异系数均在6%以内。结果表明,本研究建立的检测Cps的MOMP抗体的间接ELISA方法特异性强、敏感性高和重复性好,且可用于鸽Cps疫苗免疫抗体水平检测与流行病学调查。

密码修饰可增强沙眼衣原体MOMP DNA质粒免疫小鼠的免疫应答

目的探讨密码修饰对沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因表达和DNA质粒免疫的影响。方法根据人类密码子使用偏好对鼠肺炎沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis mouse pneumoni-tis)MOMP基因进行优化修饰,设计合成人源化MOMP基因(HuMOMP)。构建以pcDNA3为载体的含HuMOMP及含野生型MOMP基因(WtMOMP)的真核表达质粒。瞬时转染COS-1细胞,Western blot方法比较HuMOMP基因及WtMOMP基因在哺乳动物细胞中的蛋白表达水平。DNA质粒肌内免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清特异性抗体、DTH和淋巴细胞增殖反应,比较优化密码MOMP基因和野生型MOMP基因DNA质粒免疫的免疫效果。结果人工合成HuMOMP基因,成功构建重组真核表达质粒pcDNA3-HuMOMP及pcDNA3-WtMOMP。转染细胞Western blot结果显示,HuMOMP基因的蛋白表达水平明显高于WtMOMP基因。ELISA结果表明,HuMOMP DNA质粒免疫组小鼠血清特异性IgG抗体有所升高;细胞免疫检测结果显示,HuMOMP DNA质粒免疫组小鼠足垫肿胀程度增强、淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)增高,两者与WtMOMP DNA质粒免疫组相比P<0.05,差异均有统计学意义。结论人源化密码修饰能够增强沙眼衣原体MOMP基因在哺乳动物细胞中的蛋白表达及DNA质粒免疫小鼠的免疫反应,这对于新型衣原体DNA疫苗的研究具有重要意义。

基于Omp1基因的泌尿生殖道感染沙眼衣原体多样性及分布特征分析

目的基于主要外膜蛋白基因(Omp1)研究泌尿生殖道感染患者沙眼衣原体多态性及分布特征,为该疾病的诊治及疫苗研究奠定基础。方法对泌尿生殖道感染临床标本常规处理后,使用沙眼衣原体核酸检测试剂盒筛选阳性标本,然后以巢式PCR扩增Omp1基因,选择4个限制性内切酶进行RFLP分析确定其基因型,选择代表菌株测定Omp1的DNA序列并与参比菌株比较确定其血清型,最后将基因型及血清型与患者的性别、科室及年龄进行对比分析,研究其分布特征。结果 2013-2014年2年间共筛选得到178份阳性标本,61份标本扩增获得Omp1基因,Omp1-PFLP分析将61份标本分为6个基因型,占比分别为24.59%,24.59%,4.92%,9.84%,3.28%和32.79%,血清型分析表明61份标本属于F,H,J,G,Da,D和E 7种血清型,E型及F型占比最多。结论本地区引起泌尿生殖道感染的沙眼衣原体主要属于F,H,J,G,Da,D和E 7种血清型,E型及F型占比最多,基因型及血清型与患者性别具有相关性,与科室、年龄无相关性。

E型沙眼衣原体主要外膜蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备E型沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)多克隆抗体,并在体外检测其生物学特性。方法通过分子克隆方法构建重组表达质粒pET21a(+)/MOMP,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组MOMP蛋白,经镍螯合亲和层析胶纯化后,经皮下多点注射免疫日本大耳白兔,制备兔多克隆抗体,分别采用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。在HeLa细胞中培养E血清型Ct,通过卢戈和吉姆萨染色法观察细胞中Ct包涵体的形成情况,间接免疫荧光法检测制备的MOMP多克隆抗体对Ct天然MOMP的结合特异性。结果Ct MOMP可在原核表达系统中高效表达;制备的兔抗MOMP多克隆抗体ELISA效价可达1∶256000,可特异性结合、识别融合及天然的Ct MOMP。结论制备的兔抗Ct MOMP多克隆抗体效价高、特异性强,为后续进一步研究Ct的致病机制及开发新的免疫诊断制剂奠定了基础。

鹦鹉热衣原体亚单位疫苗免疫原性及免疫保护性研究

本研究将鹦鹉热衣原体的MOMP基因经PCR扩增后与pET-22b(+)载体连接构建重组质粒,转化入E.coli,通过IPTG诱导表达MOMP蛋白,鉴定重组蛋白的表达和反应性。结果显示,重组蛋白被成功表达,分子质量大小为40 ku,经溶解、透析纯化后,重组MOMP蛋白纯度为91%,能与鼠抗重组MOMP蛋白抗体产生特异性反应,与鹦鹉热衣原体阳性血清呈强阳性反应。重组MOMP蛋白与ISA201佐剂乳化制成鹦鹉热衣原体亚单位疫苗,免疫绵羊后抗体效价高达1∶4222,用强毒株攻毒后保护率达100%,表明此鹦鹉热衣原体亚单位疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性。