Uncertainty in Measuring Construct-specific Fragments of Genetically Modified Maize MON863 by Real Time Quantitative PCR

[Objective] The study aimed at evaluating the uncertainty in measuring the construct-specific fragments of genetically modified maize MON863 by real time quantitative PCR.[Method] The content of construct-specific fragments in MON863 samples was determined by real time quantitative PCR,and then the uncertainty of measurement result was evaluated according to the sources of uncertainty like the PCR system,the data processing and the micropipette.[Result] Type A evaluation of uncertainty（uA） in the measurement was 1.7×10^-2;Type B evaluation of uncertainty（uB） was 9.0×10^-4;the combined standard uncertainty（uC） was 1.7×10^-2;the expanded uncertainty（U95） was 0.036 and the finally measured result was 1.08%±0.036.[Conclusion] The main uncertainty of the result measured by real time quantitative PCR came from the randomizing effect in the experimental process.

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度

[目的]对实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度进行评定。[方法]使用转基因玉米MON863结构特异实时定量PCR方法测定含量为1%的转基因玉米MON863样品(CRM)中结构特异片段的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定测量的不确定度。[结果]研究得到uA=1.7×10-2,uB=9.0×10-4,uC=1.7×10-2,U95=0.036,测量结果为1.08%±0.036。[结论]转基因玉米MON863结构特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。

转基因玉米MON863品系特异定量PCR方法的建立

根据转基因玉米MON863外源基因的旁侧序列,设计引物和TaqMan探针,建立了转基因玉米MON863品系特异定量PCR检测方法,并采用该法检测了1%含量的MON863玉米粉末(不确定度为10%)。结果显示,采用构建的方法获得的标准曲线斜率为-3.6～-3.1,相关系数大于0.99,扩增效率为102.2%,在90%～110%内。样品的定量检测结果1.113%接近已知含量1%(不确定度为10%),表明建立的转基因玉米MON863品系特异定量PCR检测方法的灵敏度和准确度高,可以在日常检验中推广应用。

转基因玉米MON863结构特异定量PCR方法的建立

根据转基因玉米MON863载体构建特异结构,设计引物和Taqman探针,建立了转基因玉米MON863载体构建特异结构定量PCR检测方法,并采用该法定量检测了1%含量的MON863标准品(不确定度为10%)。结果显示,采用本文构建的方法获得标准曲线斜率,在-3.6～-3.1之间,相关系数大于0.99,扩增效率为105.436%,在90%～110%的范围内。待检样品的定量检测结果(1.08%)非常接近真实值(1%,不确定度为10%),表明本文建立的转基因玉米MON863结构特异定量PCR检测重复性好,灵敏度和准确度高,可以在日常检验中推广应用。

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863的测量不确定度分析

应用四川省农业科学院分析测试中心实验室建立的转基因玉米MON863品系特异实时定量PCR方法,测定含量为1%的转基因玉米MON863样品(CRM)中旁侧片段(品系特异片段)的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源评定测量的不确定度。结果表明,uA=1.9×10-2,uB=9.3×10-4,uC=1.9×10-2,U95=0.04,测量结果为1.108%±0.04。MON863品系特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。

环状等温扩增技术快速检测转基因玉米MON863的研究

采用环状等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对转基因玉米品系MON863中玉米基因组与外源基因结合处设计4条特异性引物,建立MON863的快速检测技术体系,并对时间、温度等反应条件及体系灵敏度、特异性等进行探索。结果表明:该检测体系最适反应温度为63℃,反应时间60 min,灵敏度是常规定性PCR的10倍。该检测方法具有高度的特异性和稳定性,操作方便、简单、省时。

Taqman-MGB实时荧光PCR定量检测转基因玉米MON863

运用实时荧光聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对转基因玉米MON863进行品种特异性检测和定量分析。通过设计玉米内源基因和外源基因边界序列特异性引物和Taqman-MGB探针,验证了内源基因的物种特异性和外源基因边界序列的品种特异性。利用已知转基因百分含量的MON863玉米作为标准品,进行荧光定量反应,建立定量标准曲线,通过标准曲线对玉米样品MON863玉米成份进行含量分析。结果表明,该方法重复性好,检测特异性强,最低检测限浓度达到0.001 ng/μL,即14个拷贝。由于使用实时荧光PCR技术,检测周期短,操作简便,可广泛运用于转基因玉米MON863的进出口检测和转基因产品的含量分析。