牛分枝杆菌MPB83基因的原核表达及免疫活性分析

利用PCR技术,以牛型分枝杆菌(M.bovis)Vallee菌株的全基因组DNA为模板,扩增出了一条600bp的MPB83基因片段,将其克隆至pMD18T载体中,经核苷酸序列测定确证后,KpnI/EcoRI双酶切,然后亚克隆到原核表达载体pET30a的相同酶切位点,构建表达质粒pETMPB83,将鉴定的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDSPAGE检测表达情况,重组质粒pETMPB83在30kDa处有一特异表达带,与预计大小相符。经Ni柱纯化后,Westernblot检测纯化蛋白具有免疫活性,用纯化的该蛋白进行动物(兔)接种制备抗血清,用Westernblot和ELISA检测该抗血清的效价和特异性,结果表明特异性较好。

表达牛分枝杆菌MPB83基因重组腺病毒的构建

以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得MPB83基因,克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MPB83经PmeⅠ酶切,转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-MPB83。PacⅠ酶切线性化该质粒,转染AD-293细胞进行病毒包装,转染细胞10d后出现细胞病变(CPE)。PCR、RT-PCR、western blot检测到重组病毒含MPB83基因并成功表达。

牛分枝杆菌MPB83基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为观察重组MPB83蛋白的免疫活性,揭示该蛋白在牛结核病的诊断和防治中的作用,克隆了牛分枝杆菌MPB83基因,构建了克隆载体pGEM-MPB83和表达载体pET30a-MPB83,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明:牛分枝杆菌MPB83基因体外扩增产物与预期值相符,约600 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB83经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为26 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。

牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果

用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况。结果表明,2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升,而2对照组始终维持在较低水平,且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后,pCE6组和pC70-83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著(P<0.05),2重组质粒免疫组间差异不显著(P>0.05);2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ均显著高于2对照组(P<0.05),且pC70-83-E6组明显高于其他3组(P<0.05)。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。

牛型结核分枝杆菌分泌性蛋白MPB70.MPB83基因串联重组质粒的构建及鉴定

目的构建牛型结核分枝杆菌(MB)分泌性蛋白mpb70.mpb83基因串联重组表达质粒,为进--步利用工程菌表达、获得相应抗原蛋白奠定实验基础。方法参考NCBI上公布的MB全基因组序列(EU683972.1),在利用DNAstar7.0生物信息软件分析分泌性蛋白mpb70、mpb83抗原性基础上,选择mpb70、mpb83基因编码多肽主要抗原域,利用重叠延伸PCR技术构建pGEX-6p-mpb70+mpb83串联重组表达质粒。结果生物信息学预测MPB70、MPB83基因的抗原域分别在30-171位氨基酸和20-190位氨基酸。在mpb70、mpb83间加入16位柔性多肽序列,在线分析不影响mpb70和mpb83融合后的抗原性。pGEX-6p-1-mpb70+mpb83经双酶切获得966bp和4966bp两条片段,与预期一致;测序表明mpb70+mpb83融合基因无碱基突变和缺失,重组质粒构建正确。结论确定了MB早期标识性分泌性蛋白mpb70、mpb83基因的抗原域,获得了mpb70、mpb83串联基因,构建的重组原核表达载体柔性多肽的引人确保mpb70和mpb83的天然抗原构象且不影响融合蛋白的抗原性,为重组抗原的表达,单克隆抗体制备以及建立MB分泌性蛋白标识物的快速检测试剂盒奠定了基础。