重组人红细胞生成素对骨髓瘤细胞株MPC-11作用的体外研究

目的:探讨重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)在体外对骨髓瘤细胞株有无抗瘤作用及其作用机制,以便为rhEPO治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)提供理论依据。方法:取对数生长期骨髓瘤细胞株MPC-11细胞以1×10~4/ml密度接种入96孔培养板中。实验设置对照组及rhEPO组(rhEPO终浓度分别为20、40、60、80、100、200、400 U/ml)。在细胞培养后收集各时间点(1、2、3、4、5、6 d)各组细胞,应用CCK-8法检测各组细胞的增殖活性,Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况,并提取各组细胞上清液,用酶联免疫定量分析(ELISA)法检测细胞上清液中IL-6、IgG和kappa轻链的水平。结果:流式细胞术结果显示:经200 U/ml rhEPO处理后的MPC-11细胞在培养21 d后细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);经400 U/ml rhEPO处理后的MPC-11细胞分别培养10、15、21 d后,其细胞凋亡率均分别高于相同时间节点的对照组(P<0.05),且细胞凋亡率随rhEPO浓度的增加和作用时间的延长而增高(P<0.05)。ELISA结果显示:rhEPO作用MPC-11细胞株15 d,400 U/ml rhEPO组细胞上清液中IL-6水平低于对照组(P<0.05);而在21 d,经100、200、400U/ml rhEPO作用下细胞上清液中的IL-6水平降低(P<0.05);培养21 d时,400 U/ml rhEPO组细胞上清液中的IgG、Kappa轻链水平均明显低于对照组(P<0.05)。结论:rhEPO可明显诱导MPC-11骨髓瘤细胞株凋亡,且与剂量和时间相关;可降低MPC-11细胞株所分泌的IgG、Kappa轻链水平,且与作用时间呈正向变化关系。

多发性骨髓瘤局部成瘤小鼠模型的建立

本研究探讨多发性骨髓瘤小鼠模型建立的方法。于BALB/c小鼠皮下接种6×105MPC-11骨髓瘤细胞,待荷瘤小鼠出现皮下结节后随机将其中5只处死,取其皮下结节进行HE染色及免疫组织化学(CD138,κ轻链)检测。同时,在荷瘤第5、7、9、11、12、35、65天进行荷瘤小鼠血清免疫固定电泳的动态监测。在荷瘤前、荷瘤后第15天和30天对荷瘤小鼠进行血红蛋白的检测。在荷瘤第35及65天进行荷瘤小鼠血清IL-6水平检测。每周观察荷瘤小鼠的生存情况,测量荷瘤小鼠的肿瘤大小,体重变化。结果表明:荷瘤小鼠出现皮下结节的高峰为荷瘤后12-15天,在荷瘤第12天荷瘤小鼠血清中可检测到单克隆免疫球蛋白。皮下结节HE染色、免疫组织化学检测CD138(+)及κ轻链(+)证实了瘤组织为浆细胞来源。荷瘤后第12天时可在小鼠血清中检测出M蛋白,表现为IgG及κ轻链的浓聚条带。荷瘤小鼠的死亡高峰为荷瘤后第20-40天,中位生存时间为31天。在荷瘤第15天时小鼠开始逐渐出现贫血,荷瘤组与正常对照组小鼠的Hb水平在荷瘤第15天及30天时差异有统计学意义(p<0.05)。荷瘤小鼠血清IL-6水平高于正常对照组。结论:采用MPC-11骨髓瘤细胞于BALB/c小鼠皮下接种(接种浓度为6×105个肿瘤细胞)建模,具有造模简单、荷瘤成功率较高、肿瘤生长变化易于观察等优点。监测本模型肿瘤大小的变化、血清IL-6水平及血清免疫固定电泳的变化可用于对多发性骨髓瘤疗效的评价。

重组人促红细胞生成素治疗多发性骨髓瘤小鼠的疗效与机制的研究

目的探讨重组人促红细胞生成素(r HuEPO)治疗多发性骨髓瘤小鼠的疗效及其可能作用机制。方法 420只BALB/c小鼠,荷瘤组410只和正常对照组10只。荷瘤组小鼠均皮下接种1×104个MPC-11骨髓瘤细胞,荷瘤后第5 d随机抽取50只作为荷瘤对照组,余小鼠随机分为3个不同剂量的r HuEPO(10 I U、20 I U、30 I U)治疗组,120只/组。r HuEPO皮下注射,每天1次,连续注射2周后减为1周3次。荷瘤对照组小鼠接受生理盐水皮下注射。荷瘤后动态监测血清M蛋白的出现时间,检测小鼠血红蛋白(Hb)水平,并取皮下结节进行病理检查。测定血清IL-6、TNF-α、TNF-γ、IgG、κ轻链浓度,全血CD4+、CD8+细胞计数(流式细胞分析方法),肿瘤组织的微血管密度(MVD)以及肿瘤细胞凋亡(TUNEL法)。结果荷瘤后22 d检测到荷瘤小鼠血清中出现M蛋白;r HuEPO治疗后,各治疗组的Hb水平及生存时间均高于荷瘤对照组(P<0.05),各治疗组间差异无统计学意义(P>0.05);r HuEPO应用2月后,各治疗组血清IL-6、IgG及κ轻链的浓度均低于荷瘤对照组(P<0.05);荷瘤小鼠的总体生存时间与Hb水平呈正相关(P=0.000)、与血清IL-6水平呈负相关(P=0.009)。结论 r HuEPO明显提高荷瘤小鼠的Hb水平并延长其生存时间,同时降低其血清IL-6水平和M蛋白水平。