食品中3种致病李氏菌MPCR-DHPLC检测方法的建立

应用复合PCR(multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的快速高通量检测方法。根据单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的特异基因序列分别设计引物,MPCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以94株参考菌株做特异性实验,并开展了重现性检测实验。MPCR-DHPLC方法同步检测到单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的特异性阳性吸收峰,未检测到李斯特菌属其他近源种和非近源种参考菌株的阳性吸收峰,且重现性良好。该方法具有很好的特异性,可以快速、准确、高通量地检测食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌,是食品微生物快速检测的新技术。

5种葡萄球菌肠毒素基因MPCR-DHPLC检测方法的建立

设计合成5种葡萄球菌肠毒素基因(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)的特异性引物,对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的反应体系进行优化后,建立5种葡萄球菌肠毒素基因的多重PCR结合变性高效液相色谱(multiplex PCR-denaturing high performance liquid chromatography,MPCR-DHPLC)检测方法,并进行MPCR-DHPLC检测特异性及灵敏度的测定,5重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100 CFU/m L。MPCR-DHPLC方法应用于食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测,具有快速、准确、高通量等优点。

食品中五种致病性弧菌MPCR-DHPLc检测方法的建立

采用试剂盒法提取5种致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组DNA。分别合成5对特异性引物,对PCR反应体系进行优化后,建立了5种致病性弧菌间的MPCR-DHPLC检测方法。二重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100CFU/ml。建立的MPCR-DHPLC方法在食品中弧菌的检测上具有很好的应用价值。

副溶血性弧菌MPCR-DHPLC检测方法的建立

目的:建立多重PCR(Multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High-Performance Liquid Chromatography,DHPLC)检测副溶血性弧菌的方法,并了解该菌携带毒力基因的情况。方法:根据副溶血性弧菌的毒力基因tdh、trh和种特异性基因toxR进行引物设计,以其单一PCR扩增产物在DHPLC出现的色谱峰作为标准色谱峰,建立MPCR-DHPLC的检测方法。结果:该方法能有效扩增副溶血性弧菌的tdh、trh和toxR基因,25株副溶血性弧菌的MPCR扩增产物经DHPLC分析所得的色谱峰在位置和峰型与标准色谱峰有很好的符合性,其他菌属的菌株均无特异性扩增,对模拟污染样品可正确检测,灵敏度达到1*103CFU/ml,特异性达到100%。结论:本文建立的MPCR-DHPLC方法可准确检测副溶血性弧菌,并了解该菌携带毒力基因的情况。

变性高效液相色谱检测空肠弯曲菌

目的应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌的快速检测方法。方法以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因为靶基因,选择2对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌的多重PCR体系,扩增产物分别为287bp、159 bp。采用22株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到10 pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24 h可被检出。结果在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性。结论本研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌的快速检测。

多重PCR-DHPLC快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌

应用多重PCR(motiplex PCR)结合变性高效液相色谱技术(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)建立了快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的方法。以基因wzx O111、rfb EO157为靶基因,建立多重PCR-DHPLC方法,进行特异性和灵敏度测试,同时进行RT-PCR检测比较灵敏度。该方法具有良好特异性,可以一次PCR扩增同时检测O111、O157;灵敏度达到25 CFU/m L。129份牛肉样品中检出1例O111,3例O157阳性;74份鸡肉样品中检测出O111、O157阳性各1例,67份蔬菜样品中未检测到O111、O157。本文建立O111、O157多重PCR-DHPLC检测方法,操作简便,特异性强,适用于产志贺毒素大肠杆菌筛选检测。

多重PCR-变性高效液相色谱检测食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌

本研究应用多重PCR反应(mPCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测方法。以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码结肠弯曲菌的cdt基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的mPCR体系,扩增产物分别为287bp、159bp和173bp。采用22株细菌验证了该mPCR具有特异性。mPCR检测的灵敏度在DNA水平上达到空肠弯曲菌10pg/μL、结肠弯曲菌1pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24h即可被检出。在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性,7份样品为结肠弯曲菌阳性。本研究建立的mPCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测。

多重PCR-变性高效液相色谱快速检测单核细胞增生李斯特菌毒力基因方法的建立

目的建立单增李斯特菌的多个靶基因快速检测手段,提高检测的准确性。方法根据单增李斯特菌4个毒力基因(hly、prfA、inlA、inlB)设计引物,通过优化引物浓度和引物组合,进行多重PCR扩增,产物经变性高效液相色谱(DHPLC)进行快速检测。结果出峰顺序依次为inlB、hly、inlA、prfA,扩增片段大小为146、210、255、388 bp,此方法具有良好的特异性,灵敏度可达到280 cfu/ml。结论本方法可以满足实际工作中食品微生物检测的要求。

水产品中常见5种致病菌的多重PCR-DHPLC快速检测方法的建立

目的建立水产品中5种常见致病菌的快速高分辨检测手段,提高检测的效率和准确性。方法筛选沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌的特异基因,通过参阅文献和自行设计,分别确定invA、nuc、prfA、tlh、owpW为检测基因,优化引物浓度和引物组合,进行多重PCR扩增,产物经DHPLC进行快速检测。优化确定的方法通过重现性试验,特异性试验,灵敏度试验,以及人工污染水产品样品的检测。结果 DHPLC检测出峰顺序依次为invA、nuc、prfA、tlh、owpW,扩增片段大小为284 bp、329 bp、388 bp、450 bp、588 bp,此方法具有良好的重现性和特异性,灵敏度分别可达188 CFU/ml、670 CFU/ml、280 CFU/ml、240 CFU/ml、580 CFU/ml,不同水产品的状态、成分以及增菌液类型对后续检测不存在影响。结论本方法可以很好的满足实际食品微生物检测的要求。