208例BCR/ABL1阴性慢性骨髓增殖性疾病JAK2、CALR、MPL基因突变检测及其诊断价值

目的:检测经典BCR/ABL1阴性慢性骨髓增殖性疾病患者JAK2、CALR、MPL基因突变,探讨其诊断价值。方法:2012年3月至2015年12月208例BCR/ABL1阴性慢性骨髓增殖性疾病患者(ET146例,PV37例,MF25例)纳入BCR/ABL1阴性CMPN组,124例继发性血小板增多及73例继发性红细胞增多症患者纳入对照组。抽取骨髓或静脉血提取基因组DNA及总RNA,进行JAK2基因外显子12至20,MPL基因外显子10以及CALR基因外显子3至9测序分析。结果:146例ET患者中,JAK2V617F突变86例(58.9%);JAK2 exon 12突变2例(1.4%);CALR突变41例(28.1%),其中Ⅰ型(c.1092_1143del)22例,Ⅱ型(c.1154_1155insTTGTC)11例,Ⅴ型(c.1091_1142del)1例,Ⅷ型(c.1104_1137del)1例,41型(c.1107_1137del)1例,42型(c.1125_1125del)1例,其他(c.1107_1115del,c.1111_1144 del,c.1101 A>C,c.1112_1117del)4例;MPL基因突变9例(6.2%)。JAK2、CALR、MPL基因突变均阴性的患者有8例(5.4%)。37例PV中检出JAK2以及CALR突变共35例(94.6%),其中JAK2V617F突变31例(83.8%),JAK2 exon 12突变2例(5.4%);CALR突变2例(5.4%),其中Ⅰ型1例,另1例为CALR c.1191_1193del。JAK2、CALR、MPL突变均阴性2例。25例MF中检出JAK2V617F突变19例(76%),CALR突变2例(8%);JAK2、CALR、MPL突变均阴性的患者有4例(16%)。124例继发性血小板增多的患者以及73例继发性红细胞增多的患者中,均未检测出JAK2、CALR或者MPL基因突变。结论:联合JAK2、CALR、MPL基因突变能覆盖大多数BCR/ABL1阴性的骨髓增殖性疾病患者,CALR突变在ET患者中检出率较高,因此CALR突变可作为JAK2、MPL突变阴性的ET的新诊断指标。

CALR基因突变与JAK2/MPL突变阴性的骨髓增殖性肿瘤的关系

2008年世界卫生组织(WHO)将JAK2V617F基因突变列为BCR/ABL阴性的骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN)特异性的分子诊断标志物,2013年国外两个研究小组同时在新英格兰杂志发表文章应用全基因组测序技术(whole genome shot-gun,WGS)检测到JAK2V617F-和MPL-的原发性血小板增多症(essential thrombocythaemia,ET)和原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF)患者中存在高频钙网蛋白(Calreticulin,CALR)突变,因此本文就CALR突变与MPN可能的关系做一综述。

单核细胞增生性李斯特菌mpl基因的克隆及其原核表达载体的构建

研究对单增李斯特菌Mpl蛋白进行了基因克隆及表达载体的构建。通过PCR方法对标准株单增李斯特菌菌株mpl基因进行扩增,并将其克隆至pET32 a(+)上构建表达载体。经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的单增李斯特菌mpl基因序列EF183452和EF183453的同源性为99.7%,氨基酸同源性为100%。试验成功地对单增李斯特菌株mpl基因进行扩增,并将其克隆至pET32 a(+)上,为下一步开展Mpl重组蛋白的应用研究奠定了基础。

原发性血小板增多症患者CALR、JAK2 V617F、MPL W515K基因突变率及临床特征分析

目的:分析原发性血小板增多症患者CALR、MPL W515K与JAK2 V617F基因突变率及临床特征。方法:对本院56例原发性血小板增多症患者,通过基因组DNA-PCR扩增产物直接测序法检测CALR与MPL W515K基因突变,并通过等位基因特异性PCR法检测JAK2 V617F基因突变。结果:56例患者中CALR基因突变14例,发生率为25.00%,其中Ⅰ型6例,Ⅱ型5例,Ⅲ型3例。Ⅰ型与Ⅱ、Ⅲ型CALR基因突变的患者在性别、年龄、血小板计数(Plt)、白细胞计数(WBC)及血红蛋白(Hb)水平的比较均无明显差异(P>0.05);Ⅲ型患者WBC计数较Ⅱ型者显著升高(P<0.05),而Ⅲ型和Ⅱ型组患者的性别、年龄、Hb及Plt的比较均无明显差异(P>0.05)。MPL W515K基因突变3例,发生率为5.36%;JAK2 V617F基因突变21例,发生率为37.50%。MPL W515K与JAK2 V617F阴性患者(18例)中CALR基因突变13例,发生率为72.22%(13/18),并无检出任一2种基因突变共存的病例。CALR突变者外周血Hb、WBC的水平较JAK2 V617F突变者均显著降低(P<0.05)。56例患者中,染色体核型异常3例,发生率为5.36%。染色体核型异常者CALR基因突变率(66.67%)较正常核型者(20.75%)显著升高(P<0.01)。结论:JAK2 V617F基因在原发性血小板增多症患者中的突变率较高,且MPL W515K与JAK2 V617F基因突变阴性者CALR突变率较高,这可能与染色体核型异常存在密切联系;CALR基因突变的原发性血小板增多症患者外周血Hb、WBC的含量较JAK2 V617F突变者均显著降低。

重组人血小板生成素对人红白血病HEL细胞增殖的影响

为了进一步阐明血小板生成素(thrombopoietin,Tpo)的生物学作用,我们研究了rhTpo(recombinant human Tpo)对人红白血病(human erythroleukemia,HEL)细胞增殖的影响。采用血浆凝块集落培养法和5-溴-2’-脱氧尿核苷(5-BrdU)掺入HEL细胞DNA-ELISA法。培养基中加入rhTpo,HEL细胞集落数量和吸光度值明显高于未加rhTPo对照组。当rhTPo浓度为10,50,100,200ng/ml时,实验组集落数分别是对照组集落数的1.5,2.07,2.34,2.46倍;实验组A值分别是对照组A值的1.28,1.84,2.25,2.31倍。研究结果表明,rhTpo促进HEL细胞增殖和DNA合成。

人血小板生成素的研究进展

血小板生成素是新近发现的一个非常重要的造血调控因子。经过40多年的不懈努力,基本上阐明了血小板生成素及其受体系统(TPO/c-Mpl)在造血调控方面的作用,并在此基础上,研制了重组血小板生成素,以治疗放疗和化疗引发的血小板减少症。本文综述了近年TPO及其受体c-Mpl系统对造血调控的研究进展,涉及TPO和c-Mpl的基因和蛋白分子结构、基因表达调控、可能经历的信号传导途径、TPO/c-Mpl系统主要的生理作用、TPO在血液循环中的代谢过程以及目前重组血小板生成素的临床研究现状等六个方面。深入理解TPO/c-Mpl系统的结构和作用,将加深人们对机体的造血调控和血液病的认识,并将有助于相关疾病的临床治疗。

慢性粒单核细胞白血病伴JAK2、MPL基因突变1例

1临床资料 患者,男,44岁,因“头晕、视力模糊2 d”于2019年6月4日就诊大连医科大学附属第一医院神经内科。入院查体:意识清晰,神经系统检查及其他体格检查基本正常。既往体健,无吸烟史。超声提示双颈动脉斑块形成,头部磁共振成像显示右侧额叶、顶叶、颞叶和枕叶出现急性缺血性梗死(图1)。外周血白细胞数和单核细胞数均较高(WBC 12.21×109/L,MONO 3.6×109/L,Hb 136 g/L,PLT 343×109/L)。外周血涂片见原始粒细胞占13%,单核细胞17%,可见幼稚单核细胞;骨髓形态示骨髓增生活跃,粒细胞、红细胞和巨核细胞增生活跃,形态大致正常,其中原始粒细胞4%,单核细胞13%,以成熟单核细胞为主(图2)。给予神经保护治疗10 d,同时抗血小板聚集治疗(阿司匹林100 mg,每日1次),视力模糊消失,头晕缓解。后转到血液科,进一步行骨髓流式分析示:原始粒细胞比例增高,占9.23%,CD34聚集表达,CD38表达强度减弱。

MPL基因突变相关先天性无巨核细胞性血小板减少症临床诊治循证研究

目的 探索MPL基因突变相关先天性无巨核细胞性血小板减少症(congenital amegakaryocytic thrombocytopenia,CAMT)的临床特征。方法 参照罕见病研究常用询证方式,归纳典型病例,收集自2010年起所有国内外46篇文献中共计85例临床数据,统计分析CAMT的临床特征和诊治效果。结果 CAMT主要特征为:女性占比高于男性(1.67∶1),起病年龄较早(平均12.1个月),诊断年龄滞后(平均46个月);以皮肤、黏膜出血为主,但22例颅内出血,其中4例宫内颅内出血;均存在不同程度外周血小板计数下降:1.0×10^(9)/L~83.0×10^(9)/L;均存在MPL基因突变,其中纯合子52例,复合杂合子33例;存在显著全血细胞减少趋势;血浆血小板生成素(thrombopoietin,TPO)水平显著增高,均值1 505.8 pg/ml;非造血系统异常表现达52%。唯一根治疗法为异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT),TPO受体激动剂为缺乏allo-HSCT条件患儿的替代药物。结论 CAMT在新生儿期或婴儿早期发病,缺乏其他特殊表现,易被误诊,需谨慎对待鉴别要点。几乎所有CAMT均可能进展为三系血细胞减低,并呈现典型再生障碍性贫血表现。艾曲波帕及罗米司亭可作为allo-HSCT的替代治疗药物。

骨髓增殖性肿瘤不典型MPL基因突变研究进展

MPL基因突变可见于1%~5%的原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)患者中,其热点突变常发生于第10号外显子,以W515、S505位点突变为主。近年来,在三阴性骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者中发现多种不典型MPL突变,包括获得性突变和胚系突变,但进一步的研究证实,已发现这些不典型MPL突变在MPN致病能力方面存在差异,提示临床上检测到的不典型MPL突变并非均为MPN真正的驱动突变。文章就不典型MPL基因突变在MPN中的研究进展进行综述。

一个新的MPL基因异常剪接体MPL L391-V392ins12的鉴定及其在248例骨髓增殖性肿瘤患者中的筛查结果

目的 鉴定MPL L391-V392ins12异常剪接体,了解其在骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中突变发生情况.方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）联合克隆测序方法对MPL基因异常剪接体进行鉴定,采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）在248例MPN患者及200名健康正常人中筛查其突变情况.结果 发现并确认了MPL基因的一个异常剪接体MPL L391-V392ins 12,即MPL基因的外显子7和外显子8之间保留了36 bp的内含子序列,导致蛋白编码序列的氨基酸位点391与392之间插入12个氨基酸（谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸）.248例MPN患者中19例（7.66％）检出MPL L391-V392ins12突变,真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）患者的检出率分别为1.92％（1/52）、9.66％（14/145）、7.84％ （4/51）;200名正常人中未检测到MPL L391-V392ins12突变.结论 MPL L391-V392ins12是存在于MPN中的一种病理性剪接体,在PV、ET、PMF中均可发生,但多见于ET、PMF,可能是MPN发病的潜在原因之一.

特发性血小板减少性紫癜患者血小板生成素相关基因表达的研究

目的:探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者骨髓血小板生成素(Tpo)和其受体c-mpl基因变化的意义。方法:用非放射性核素细胞原位杂交法检测tpo、c-mpl mRNA;细胞免疫化学法检测巨核细胞MPL。结果:ITP患者骨髓tpo、c-mpl mRNA,巨核细胞MPL表达增高。结论:c-mpl基因是在转录水平调控的;人体骨髓内对tpo及其受体的调节是以负反馈方式进行的;ITP患者骨髓局部tpo表达增高,病理情况下巨核细胞MPL增高可能与循环Tpo水平降低有关。

白血病相关原癌基因在氢醌处理TK6细胞中的表达

目的探索氢醌(hydroquinone,HQ)致DNA整体低甲基化的后续结果。方法用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0、10.0和20.0μmol/L HQ染毒TK6细胞为处理组。应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测白血病相关原癌基因MPL、BRAF、ERBB2、MYB、MYC和RAF1的表达水平。结果与对照细胞相比,HQ处理细胞MPL和RAF1的mRNA表达量都随HQ剂量增加而上升,其中20μmol/L HQ对原癌基因表达的影响最为明显,分别上升了80%(P<0.05)和35%(P<0.05);MYB、MYC和ERBB2基因的mRNA表达量随HQ的剂量上升而下降。结论 MPL的转录活化很有可能与HQ导致的DNA整体低甲基化有关。