结核分支杆菌MPT63抗原的表达及其血清学诊断价值的研究

获得结核分支杆菌重组MPT6 3蛋白 ,研究其免疫学特性 ,评价其在结核病血清学诊断中的价值 ,寻找更有效的结核病诊断试剂。方法 :应用基因工程技术表达、纯化MPT6 3蛋白 ,通过Westernblotting和免疫双扩散试验分析其抗原性 ,通过斑点免疫试验、结明试验和结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 :重组质粒 pET2 4b -MPT6 3测序表明具有正确的编码序列 ,MPT6 3蛋白在大肠杆菌细胞内以可溶性蛋白的形式高效表达 ,表达量占菌体总蛋白的 40 %左右 ,分子量约 16kDa ,Westernblotting和免疫双扩散试验检测抗结核抗体的阳性率分别为 46 .7%和 5 0 % ,结核病一步法检测的阳性率为 70 % ,结明试验的阳性率为 80 %。在34例正常血清中 ,MPT6 3和PPD斑点免疫试验检测抗结核抗体的阳性率分别为 38.2 %和 35 .3 % ,结核病一步法检测的阳性率为 2 3 .5 %。结论 :pET2 4b -MPT6 3大肠杆菌工程菌能以可溶性蛋白的形式高效表达 ,重组的MPT6 3也许可作为结核病血清学诊断的一组抗原之一。

MPT63核酸疫苗的制备及其免疫原性

扩增结核分枝杆菌分泌蛋白MPT63编码序列 ,克隆于真核表达载体pJW 4 30 3中 .转染COS 7细胞 ,用Western印迹检测表明该基因在细胞内得到正确表达 .用该质粒连续免疫C5 7BL 6小鼠 3次后 ,用纯化的重组蛋白MPT63检测小鼠血清中的抗体 ,发现抗体滴度达到 10 5,免疫动物中γ干扰素的含量达到 2 5 8± 0 2U ml ,为空载体DNA免疫对照组的 2 0倍以上 。

结核分支杆菌特异性抗原重组蛋白MPT63检测系统的建立

目的建立规范的结核分枝杆菌（MTB）特异性抗原重组蛋白MPT63酶联免疫吸附试验（EHSA）检测系统。方法采用方阵法确定蛋白包被浓度和酶标二抗浓度，以ROC曲线法确定MPT63蛋白EHSA法检测的cut一0ff值。探讨规范的EHSA检测系统建立的方法。结果EUSA检测系统M蹦3蛋白包被浓度1：128000，酶浓度1：1000时为最佳；在cut—ofr值为0．35—0．40时检测MPT63蛋白抗体的灵敏度和特异性最为理想，分别是75．0％和78．6％。结论用方阵法确定蛋白包被浓度和酶标二抗浓度，并以ROC曲线法确立cut—ofr值是建立规范化的EMSA检测系统的关键环节。

结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的表达及纯化

目的克隆结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的编码基因Rv1926c,并在大肠杆菌中表达纯化,获得结核分枝杆菌重组MPT63蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1926c基因编码序列,克隆入原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组MPT63抗原蛋白。结果测序表明重组质粒pET30aRv1926c具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白MPT63在大肠杆菌中以包涵体形式稳定表达。结论结核分枝杆菌MPT63重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。

三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及其在抗原检测中的应用

目的制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6、MPT84和MPT63-MPT70重组蛋白抗体,探讨其在检测结核抗原中的应用价值。方法应用重组蛋白CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63- MPT70免疫血清,制备包被抗体和标记抗体,建立检测3种蛋白的双抗体夹心法,并将其用于17种分枝杆菌培养上清液和341份临床血清标本的检测。结果CFP10-ESAT-6的最低检出浓度为25 ng/mL,MPT64和MPT63-MPT70均为50 ng/mL。CFP10-ESAT-6检测17种分枝杆菌培养上清液,只有结核分枝杆菌为阳性;而MPT64和MPT63-MPT70检测除结核分枝杆菌阳性外,还各有5种非结核分枝杆菌培养上清液为阳性结果。CFP10-ESAT6、MPT64和MPT63-MPT70检测165例临床诊断的肺结核患者血清标本阳性率分别为33.9%、41.2%和47.9%;检测112例非结核患者血清标本的假阳性率分别为1.8%、7.1%和10.7%;检测64例健康对照的假阳性率分别为0、3.1%和7.8%。结论CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白制备的抗体检测血清标本结核抗原的阳性率均不高,但特异性较好。