结核分枝杆菌MPT64抗原对巨噬细胞凋亡的抑制作用

目的探讨结核分枝杆菌MPT64抗原对RAW264.7巨噬细胞的影响及相关机制。方法将MPT64基因在大肠杆菌中表达、纯化,获得的纯化蛋白用于后续实验。将用佛波醇酯(PMA)分化的RAW264.7巨噬细胞分为对照组、卡介菌纯蛋白衍生物(BCGPPD)诱导组、BCG-PPD+MPT64共同作用组,分别给予相应的处理。孵育16 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,用ELISA试剂盒检测培养细胞上清的细胞因子TNF-α及IL-10水平。结果 BCG-PPD可以诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡,BCG-PPD+MPT64组的细胞凋亡水平低于BCG-PPD组(P<0.05)。细胞因子上清检测结果表明,与对照组相比,BCG-PPD作用组的TNF-α水平升高(P<0.01),而IL-10水平无明显变化;与BCG-PPD组相比,BCG-PPD+MPT64共同孵育组的IL-10水平升高(P<0.01),而TNF-α水平无明显变化。结论 MPT64抗原可能是一种毒力因子,能够抑制BCG-PPD诱导的巨噬细胞凋亡,该作用可能是通过提高IL-10水平来实现的。

结核分枝杆菌MPT64抗原对巨噬细胞的影响及其与Toll样受体-2的相关性

目的观察结核分枝杆菌MPT64抗原对RAW264.7巨噬细胞凋亡及Toll样受体-2(toll-like receptor 2,TLR-2)表达的影响。方法将佛波肉荳蔻醋酸(phorbol myristoyl acetate,PMA)分化的RAW264.7巨噬细胞分为阴性对照组、卡介菌纯蛋白衍化物(purified protein derivative of BCG,BCG-PPD)诱导组、PPD+MPT64共同作用组,孵育16 h后,Annexin V-FITC染色,用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)和Western blot检测细胞凋亡、细胞膜及细胞内TLR-2的表达情况。结果 BCG-PPD可以诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡,PPD+MPT64作用组的细胞凋亡水平明显低于BCG-PPD组,随着MPT64蛋白浓度的逐渐增高,凋亡水平逐渐降低。FCM和Western blot技术检测结果表明,BCG-PPD组的TLR-2表达水平明显高于阴性对照组,在诱导16 h达到高峰。而在PPD+MPT64组,细胞膜及细胞内的TLR-2水平均明显低于BCG-PPD组。结论 MPT64抗原能够抑制PPD诱导的巨噬细胞凋亡,可能通过调节TLR-2的表达水平来实现。MPT64抗原可能是一种毒力因子,在结核分枝杆菌感染机体的过程中,通过抑制巨噬细胞凋亡参与宿主与结核分枝杆菌的相互作用。

结核分枝杆菌MPT64抗原对淋巴细胞的作用

目的分析结核分枝杆菌MPT64抗原对EL4淋巴细胞瘤的影响及相关机制。方法将EL4淋巴细胞分为3组,分别为阴性对照组、MPT64低剂量组(10μg/ml)、MPT64高剂量组(15μg/ml)。孵育16 h后;AnnexinV-FITC染色,用流式细胞仪检测细胞凋亡,用酶联免疫吸附剂测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测培养细胞上清的细胞因子水平,用实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和Western blot检测凋亡基因Fas、FasL的表达水平。结果 MPT64可以诱导EL4淋巴细胞凋亡,并呈浓度依赖性。与阴性对照组相比,白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)和转化生长因子β(transformation growth factor beta,TGF-β)分泌水平明显升高,而干扰素γ(interferon gamma,IFN-γ)的分泌水平未见明显变化。在MPT64诱导淋巴细胞凋亡的过程中,Fas基因表达升高。结论MPT64抗原能够诱导EL-4淋巴细胞凋亡,这种促凋亡作用可能与IL-4和TGF-β分泌水平的升高、Fas基因的表达升高相关。MPT64抗原可能是一种毒力因子,在结核分枝杆菌感染机体的过程中,可能通过促进淋巴细胞凋亡参与机体与结核分枝杆菌的相互作用。

遍在蛋白质-结核MPT64融合基因DNA疫苗的构建及免疫效应

目的:用遍在蛋白质调节结核杆菌单一抗原DNA疫苗,以期获得更强的免疫保护。方法:构建结核杆菌MPT64抗原DNA疫苗(pM)和遍在蛋白质基因与MPT64抗原基因融合的DNA疫苗(pUM)。分别将构建的两种DNA疫苗肌内注射免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)、细胞因子(IFN-γ、IL-4)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较融合基因DNA疫苗和单基因DNA疫苗诱导的免疫应答强度。结果:pM组小鼠血清IgG水平高于pUM组(P<0.01),但IgG2a/IgG1比值低于pUM组(P<0.05)。与pM组相比,pUM组小鼠IFN-γ分泌水平增高(P<0.01),IL-4分泌水平下降(P<0.01);pUM组的CTL活性高于pM组。提示融合基因DNA疫苗诱导的抗原特异性体液免疫应答不及单基因DNA疫苗,但其能诱导更强的细胞免疫应答。结论:遍在蛋白质-MPT64融合基因DNA疫苗对于防治结核病可能比单基因DNA疫苗更为有效。