结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定

目的 :构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT6 4重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 .方法 :用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出MPT6 4基因片段 ,插入 pGEM T easy载体中 ,序列测定正确后 ,将其亚克隆到表达载体pProEXHTb中 ,在大肠杆菌DH5α中表达 .结果 :获得结核分枝杆菌MPT6 4成熟蛋白基因 ,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致 ;表达蛋白经SDS PAGE分析 ,相对分子质量与文献报道一致 ;重组蛋白经蛋白印迹实验 ,在Mr2 .6× 10 4位置有特异条带 .MPT6 4蛋白在宿主菌中表达量约占菌体总蛋白的 13.5 % .结论 :基因重组表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于结核病的预防疫苗的研制和皮肤免疫诊断试剂的制备 .

结核分枝杆菌MPT64-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的:测定MPT64与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力.方法:将MPT64与ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次,每次间隔2wk,ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.最后一次免疫完成后4wk,分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞刺激指数,ELISA检测悬液中IFNγ水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4wk后计数脾脏细菌负荷数.结果:MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度1∶1500,免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为2.23,而生理盐水免疫组只有0.88;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFNγ为(4.28±0.27)μg/L,显著高于生理盐水免疫组[(0.48±0.17)μg/L,P<0.05],但不及BCG免疫组[(5.18±0.31)μg/L].与生理盐水免疫组(细菌负荷6.45±0.17)相比较,融合蛋白免疫的小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,细菌负荷为5.04±0.11,但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微(细菌负荷4.38±0.22).结论:MPT64与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的免疫学特性

目的 :研究结核分枝杆菌 (MTB)分泌蛋白MPT6 4的免疫学特性 .方法 :用原核表达的MPT6 4蛋白免疫BALB/c小鼠 ,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测IFN γ 产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖 ,并对脾脏细菌负荷计数 .结果 :MPT6 4免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显着 .MTT方法检测小鼠的IFN γ 量为 1 0 2 4ng/L ,而生理盐水对照组低于 80ng/L .结论 :MPT6

结核分枝杆菌差异蛋白MPT64与ESAT6的融合表达与纯化

目的:融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64ESAT6,为结核病的预防提供可供选择的有效亚单位疫苗.方法:设计含不同酶切位点的mpt64和esat6引物,采用PCR的方法从结核分枝杆菌毒株H37RvDNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与Teasy载体连接测序.将测序正确的mpt64和esat6按照不同的酶切位点克隆入pProEXHT表达载体,挑选出阳性克隆,将诱导的表达产物进行SDSPAGE蛋白电泳分析,同时与6×His的mAb进行Westernblot分析,并用NiNTA亲合柱纯化表达产物.结果:PCR获得的mpt64和esat6序列与GenBank报道的完全一致.两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物Mr为38×103,与预计大小相吻合.Westernblot结果显示,在Mr约38×103处有表达产物与6×HismAb特异性结合带.表达产物为包涵体,通过NiNTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白.结论:结核分枝杆菌的分泌蛋白MPT64和ESAT6被成功的融合表达,有望为结核的临床判定提供有效的诊断试剂.

重组结核分枝杆菌黏附素、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值比较

目的探讨重组结核分枝杆菌黏附素(heparin-binding hemagglutinin adhesin,HBHA)、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例、恶性胸腔积液患者40为研究对象,以HBHA、MPT64、38kD蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者胸腔积液中IgG抗体滴度。结果结核性胸腔积液组3种抗原对应的IgG抗体吸光度均数分别为0.630,0.430,0.470;恶性胸腔积液组3种抗原对应抗体吸光度均数分别为0.340,0.248,0.271,结核组高于恶性胸腔积液组,差异有统计学意义(P<0.001);ROC曲线分析结果显示,胸水中HBHA抗体的诊断临界值定为0.46时用于鉴别诊断结核性胸膜炎和癌性胸水的敏感度为90.7%、特异度为90.0%、准确度为90.4%。诊断准确度高于MPT64及38kD蛋白。结论 HBHA蛋白抗体对于结核性胸膜炎与癌性胸水的鉴别诊断具有重要价值,优于MPT64及38kD蛋白。

结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定

目的 对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原。

重组结核分枝杆菌黏附素、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值比较

目的探讨重组结核分枝杆菌黏附素（heparin-bindinghemagglutininadhesin，HBHA）、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例、恶性胸腔积液患者40为研究对象，以HBHA、MPT64、38kD蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测患者胸腔积液中IgG抗体滴度。结果结核性胸腔积液组3种抗原对应的IgG抗体吸光度均数分别为0．630，0．430，0．470，恶性胸腔积液组3种抗原对应抗体吸光度均数分别为0．340，0．248，0．271，结核组高于恶性胸腔积液组，差异有统计学意义（P〈0．001）；ROC曲线分析结果显示，胸水中HBHA抗体的诊断临界值定为0．46时用于鉴别诊断结核性胸膜炎和癌性胸水的敏感度为90．7％、特异度为90．0％、准确度为90．4％。诊断准确度高于MPT64及38kD蛋白。结论HBHA蛋白抗体对于结核性胸膜炎与癌性胸水的鉴别诊断具有重要价值，优于MPT64及38kD蛋白。

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达、纯化和复性

目的 构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的重组质粒,并在大肠杆菌中表达及纯化和复性重组蛋白.方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出mpt64基因片段,插入PKRX-T载体中,再亚克降到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签（His-Tag）纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构.结果 构建了含MPT64重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白MPT 64,其占细胞总蛋白的20%～30%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构.结论 具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原.

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用

目的 获得重组MPT64蛋白 ,研究其免疫学特性 ,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白 ,通过Westernblotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原 ,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET1 5b MPT64测序表达除 83位密码子由CCA突变为CCG外 ,其余密码子均与报道的相同 ,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL2 1 (DE3)细胞内以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 2 0～ 30 % ,分子量约 2 6kDa ,Westernblotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为 80 %左右 ,每1 0 0ml培养菌可获得 1 0mg左右的重组蛋白。以 33例正常人血清的OD值 + 2S为正常界限值 ,PDD的特异性和敏感性分别为 94% ( 31 /33)、63.7% ( 2 1 /33)、66.7% ;rMPT64纯化蛋白分别为 94% ( 31 /33)、30 .3( 1 0 /33) ;一步法分别为 88% ( 2 9/33)、66.7% ( 2 2 /2 3)。结论 pET1 5b MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白 ,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

应用MPT64为靶标快速检测结核分枝杆菌生长的研究

目的探讨应用MPT64作为快速检测结核分枝杆菌生长指示的可能性,以期建立一种准确、快速、简便、易于普及开展的结核分枝杆菌生长检测方法。方法应用BACTEC MGIT960分枝杆菌快速培养仪器系统培养法对4株结核分枝杆菌1 mg/mL纯培养物菌液进行10倍稀释共7个稀释浓度的32例菌悬液、64例涂片抗酸染色阳性样本及98例非选择性临床送检样本进行培养。同时,对菌悬液,高浓度MPT64检测阳性时,即对下一浓度每天进行1次MPT64检测,对涂片阳性样本培养管每天进行1次MPT64检测,阴性者检测至培养阳性出现或至培养42 d;对非选择性临床送检样本每周定时进行1次MPT64检测,阴性者检测至培养6周。结果(1)4株结核分枝杆菌1 mg/mL纯培养物菌液稀释试验显示:应用MPT64作为快速检测结核分枝杆菌生长指示的最小菌量为10-7～10-6mg/mL,仪器系统培养法为10-6～10-5mg/mL。(2)64例涂片抗酸染色阳性样本63例培养阳性,其中菌种鉴定为结核分枝杆菌的58例样本中56例MPT64检测阳性,检出时间为3～16 d,平均7.8 d,其培养阳性检出时间为6～30 d,平均13.7 d。其余5例非结核分枝杆菌培养物的MPT64检测阴性全部阴性。(3)98例非选择性临床送检样本中29例培养阳性,其中菌种鉴定为结核分枝杆菌的26例样本MPT64检测全部阳性,培养阳性检出时间为7～39 d,平均19.2 d,MPT64检测阳性结果均在4周内呈现;在69例培养阴性样本中有2例MPT64检测阳性,分别在培养3、4周末检出,增补结核分枝杆菌DNA扩增实验,结果阳性;其余67例MPT64检测阴性培养样本和3例非结核分枝杆菌培养样本培养物在培养6周末时MPT64检测均为阴性。(4)以BACTEC MGIT960快速培养系统方法为参照,应用MPT64检测指示结核分枝杆菌生长方法的敏感性为97.61%、特异性为97.43%。结论应用MPT64为靶标快速检测结核分枝杆菌生长,结果准确、快速,操作简便,但如何确定最佳检测时点则需要进一步探讨。

结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

目的研究结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法用表达MPT64的真核表达质粒pcDNA-M免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、流式细胞仪计CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应。结果MPT64基因免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖显著,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+细胞和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显。结论MPT64 DNA疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗的组分。

免疫层析法检测MPT64蛋白在结核与非结核分枝杆菌鉴定中的临床应用价值

目的评价免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌的临床应用价值。方法采用免疫层析法检测201株分枝杆菌,其中包括4株结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex,MTC)标准株、135株结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株、17株非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacterium,NTM)标准株和45株NTM临床分离株的MPT64蛋白。结果 4株MTC标准菌株和135株MTB临床分离株中,138株MPT64蛋白检测阳性,1株检测为阴性,敏感性为99.3%(138/139),17株NTM标准株和45株NTM临床分离株MPT64蛋白检测均为阴性,特异性为100%(62/62),201株结核和非结核分枝杆菌MPT64蛋白检测的准确度为99.5%(200/201)。结论应用免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌敏感性高,特异性强,方法简便、快速、准确,具有良好的临床应用前景。

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^(-7) g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。

结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较

目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 .

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 .方法 :采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT6 4编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3经PCR扩增融合 ,定向克隆入 pcDNA3.1(+)中 .采用脂质体转染法将pcDNA/Ag85B MPT6 4 (pcDNA/AM )转染COS 7细胞 ,用RT PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达 .结果 :Ag85B MPT6 4融合基因经双向DNA序列测定 ,碱基突变率为 0 .11%(2 /170 7) ,突变为无意义突变 ;重组质粒转染COS 7细胞后经检测证实 ,该融合基因能在真核细胞中表达 .结论 :成功地构建了Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 。

结核分枝杆菌MPT64抗原对巨噬细胞凋亡的抑制作用

目的探讨结核分枝杆菌MPT64抗原对RAW264.7巨噬细胞的影响及相关机制。方法将MPT64基因在大肠杆菌中表达、纯化,获得的纯化蛋白用于后续实验。将用佛波醇酯(PMA)分化的RAW264.7巨噬细胞分为对照组、卡介菌纯蛋白衍生物(BCGPPD)诱导组、BCG-PPD+MPT64共同作用组,分别给予相应的处理。孵育16 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,用ELISA试剂盒检测培养细胞上清的细胞因子TNF-α及IL-10水平。结果 BCG-PPD可以诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡,BCG-PPD+MPT64组的细胞凋亡水平低于BCG-PPD组(P<0.05)。细胞因子上清检测结果表明,与对照组相比,BCG-PPD作用组的TNF-α水平升高(P<0.01),而IL-10水平无明显变化;与BCG-PPD组相比,BCG-PPD+MPT64共同孵育组的IL-10水平升高(P<0.01),而TNF-α水平无明显变化。结论 MPT64抗原可能是一种毒力因子,能够抑制BCG-PPD诱导的巨噬细胞凋亡,该作用可能是通过提高IL-10水平来实现的。

结核分枝杆菌mpt64基因重组穿梭表达载体的构建与鉴定

目的在分枝杆菌系统中表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64。方法用PCR法扩增mpt64基因,构建表达载体穿梭质粒pDE22-mpt64。在母牛分枝杆菌中表达MPT64蛋白,间接免疫荧光和Western-blot鉴定、离子亲和层析法纯化目的蛋白。结果大肠—分枝杆菌穿梭质粒pDE22-mpt64可以在母牛分枝杆菌中复制并表达26kDa蛋白。蛋白印迹实验证实可与抗His单克隆抗体特异结合。结论成功构建了结核分枝杆菌mpt64基因重组穿梭表达质粒,为进一步研究该蛋白奠定了的基础。