牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。

结核分枝杆菌MPT83蛋白的表达纯化及其在免疫学诊断上的应用

目的本试验旨在表达纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,使用临床样本初步评估其在免疫学诊断结核病(tuberculosis,TB)中的应用价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增出mpt83基因,连接到pET-21a(+)中构建原核表达载体,转入感受态细胞DH5α,进行菌落PCR筛选阳性克隆。提取菌落PCR为阳性菌株的重组质粒pET-mpt83,对其进行双酶切鉴定,并将阳性克隆进行测序。将测序正确的质粒转入BL21感受态细胞中进行诱导、表达后通过镍柱亲和层析法纯化。使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及免疫印迹(Western Blot)鉴定纯化产物。用纯化MPT83蛋白免疫小鼠制备鼠多克隆抗血清。分别收集8例临床诊断结核性胸膜炎患者(TB组)的胸水和血浆,8例腺癌患者(CA组)的胸水和血浆以及8名健康对照者(HC组)的血浆。采用间接ELISA法检测样本中识别MPT83蛋白的特异性抗体水平。结果成功表达纯化出结核分枝杆菌MPT83蛋白。MPT83鼠多克隆抗血清效价可高达1∶1280000。TB组血浆MPT83抗原特异性抗体水平显著高于HC组,差异有统计学意义(P<0.05);而CA组血浆中抗原特异性抗体水平与HC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。TB组和CA组的胸水与HC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。利用ROC曲线分析不同稀释度下TB组血浆和HC组血浆OD值,曲线下面积均大于0.7,显示出较高的诊断效能。结论MPT83蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病免疫学诊断方面具有很大的应用价值。

结核分枝杆菌Dnak和MPT83蛋白的抗原性评价

目的对两种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)蛋白Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873)进行抗原性评价,为结核病免疫诊断和疫苗研究提供实验依据。方法通过基因重组和蛋白质纯化技术,克隆表达和纯化结核分枝杆菌蛋白Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873)。收集人群包括结核病患者、非结核病其他肺部疾病患者和健康志愿者的血液标本,以基因重组Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873)蛋白作抗原,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和效应T细胞酶联免疫斑点试验(ELISPOT)分别进行人群体液和细胞免疫学检测,分析其免疫学性能。结果成功获得基因重组表达和纯化的结核分枝杆菌蛋白Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873),以这两种蛋白质作抗原进行人群体液和细胞免疫学检测。体液免疫检测,用ELISA检测135名结核病患者、56名非结核病其他肺部疾病患者和94名健康人的血清特异性IgG抗体,结果显示,Dnak(Rv0350)检测的灵敏度、特异度和准确率分别为77.80%(105/135)、56.70%(85/150)和66.67%(190/285);MPT83(Rv2873)检测的灵敏度、特异度和准确率分别为76.30%(103/135)、43.30%(65/150)和58.95%(168/285)。细胞免疫检测,用ELISPOT检测59名结核病患者、65名非结核病其他肺部疾病患者和64名健康志愿者的外周血单核细胞被抗原刺激后效应T淋巴细胞产生γ干扰素(IFN-γ)的水平,结果显示,Dnak(Rv0350)检测的灵敏度、特异度和准确率分别为66.10%(39/59)、62.79%(81/129)和63.83%(120/188);MPT83(Rv2873)检测的灵敏度、特异度和准确率分别为47.46%(28/59)、79.84%(103/129)和69.68%(131/188)。结论结核分枝杆菌Dnak(Rv0350)和MPT83(Rv2873)蛋白均具有较好的抗原性,并且刺激T细胞产生免疫应答的能力较强,两者联合可能对于结核病免疫诊断和新型抗结核疫苗研究有更好的应用价值。

结核分枝杆菌MPT83的免疫原性及其奶牛结核病血清学检测方法的建立

【目的】利用大肠杆菌系统表达并纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,通过小鼠模型评价其免疫原性,建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病临床检测,评价其应用潜能。【方法】构建p ET30a(+)-mpt83重组质粒,转化BL21(DE3)诱导表达并纯化,经细胞表面分子的流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析、ELISPOT试验等分析其在小鼠中的免疫原性,建立间接ELISA方法,检测临床奶牛血样,评价其用于牛结核病血清学检测的潜能。【结果】SDS-PAGE显示目的蛋白成功表达,Western blot证实其对兔抗H37Rv多抗血清具有良好免疫反应性;FCM结果显示其下调树突状细胞表面CD80分子的表达,上调小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞表面CD69的表达,ELISPOT结果表明其诱导的特异性IL-4分泌细胞数显著高于IFN-γ分泌细胞数,表现为Th2型免疫应答;建立了ELISA方法,检测临床奶牛血样200份,与牛结核外周血γ-干扰素体外释放试验结果的阳性符合率和阴性符合率分别为48.6%和90%。【结论】在大肠杆菌系统中高效可溶性表达MPT83蛋白,其在小鼠模型中主要呈现Th2型免疫应答,并以该蛋白为抗原建立了牛结核病血清学检测的间接ELISA方法。