生长抑制因子1基因核定位序列绿荧光蛋白融合表达载体的构建及表达

目的构建p33ING1b核定位序列(nuclearlocatingsequence,NLS)绿荧光蛋白融合表达载体,将其转染到人胚肺纤维母细胞系MRC5,建立稳定表达该融合蛋白的细胞模型。方法应用逆转录PCR获得p33ING1b的NLS序列,然后将NLS序列插入绿荧光蛋白融合表达载体pEGFP C1的多克隆位点,构建pEGFP C1NLS绿荧光蛋白融合表达载体,再用此载体转染MRC5细胞系,观察活细胞绿荧光蛋白的亚细胞定位。结果成功构建了pEGFP C1NLS绿荧光蛋白融合表达载体,由该载体表达的绿荧光蛋白NLS肽段融合蛋白产生的绿色荧光信号全部定位于胞核部位,而空载体转染的细胞表达的绿色荧光蛋白,绿色荧光信号定位于细胞浆中。结论在活细胞内,生理情况下P33ING1b完全定位于细胞核,并且在其亚细胞定位的转运过程中,NLS肽段起着决定性作用。

不同半夏炮制品抗肺纤维化作用的体外筛选及体内评价

目的探讨不同半夏炮制品体外抗肺纤维化的作用及筛选出的半夏制品对肺纤维化小鼠的干预作用。方法用10μg/L转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人胚肺成纤维细胞系(MRC-5)建立肺纤维化体外模型,经水提生半夏(2.1、4.2、8.4、16.7 g/L)、清半夏(2.1、4.2、8.4、16.7 g/L)、法半夏(2.1、4.2、8.4、16.7 g/L)和姜半夏(2.1、4.2、8.4、16.7 g/L)分别处理48 h后,通过CCK-8法检测细胞活性、天狼星红染色法测定胶原含量进行抗纤维化筛选。用Western blot分析筛选出的生半夏干预MRC-5细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的情况。C57BL/6N小鼠经口腔进行气管滴注博来霉素(2 mg/kg)建立肺纤维化模型,第14天开始灌胃生半夏水提液(2.5、5.0、10.0 g/kg),第28天取肺组织经HE和Masson染色观察,并测定羟脯氨酸(HYP)含量。结果与对照组比较,TGF-β1诱导后的MRC-5细胞对生半夏(8.4 g/L)的细胞活性抑制作用更敏感(P<0.05),而未经TGF-β1诱导的MRC-5细胞则需要更高浓度的生半夏或清半夏(16.7 g/L)抑制细胞活性(P<0.05)。与模型对照组比较,生半夏(8.4、16.7 g/L)能够抑制TGF-β1诱导的胶原合成(P<0.05),清半夏、法半夏、姜半夏各组未见抑制效应。与模型对照组比较,生半夏(2.1、4.2、8.4 g/L)能够抑制TGF-β1诱导的MRC-5细胞中α-SMA蛋白的表达(P<0.05)。生半夏(10 g/kg)能够缓解肺纤维化模型小鼠肺间质中的炎性浸润,恢复肺泡结构,减少胶原沉积,降低肺组织中的HYP含量(P<0.05)。结论生半夏对TGF-β1诱导后的病理性肌成纤维细胞具有活性抑制作用,并能阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,抑制其胶原合成,缓解模型小鼠的肺纤维化进展,为临床应用半夏治疗肺纤维化提供新的思路。